大黄素抗胰腺癌作用及机制研究

论文摘要

胰腺癌是胰腺的外分泌腺癌,为临床上常见的消化系统恶性肿瘤。胰腺癌发病率约占全部恶性肿瘤的1%～7%,但是近年来在全球范围内,其发病率呈明显增加趋势。目前在西方国家,胰腺癌已成为十种最常见的恶性肿瘤之一,在我国年发病率为5.1/10万,即每年新增5-6万例,其发病率已上升到第五位,其中男性胰腺癌的发病率已经接近欧美发达国家,成为近期肿瘤发病率升高最为明显的恶性肿瘤。美国国立卫生研究院（NIH）曾经报告,在美国胰腺癌1年生存率为8%,5年生存率为3%,中位生存期仅2-3月。在我国,3/4的胰腺癌患者确诊后生存期不超过6个月,病情凶险,死亡率高,是预后最差的癌肿之一。因此,胰腺癌的治疗是国内外医学界面临的一个重大难题和严峻挑战。胰腺癌经确诊后的首选治疗方法仍为手术治疗,但根治性手术切除率不到20%。吉西他滨（Gemcitabine, GEM）的问世是胰腺癌的治疗的一个重大进展,现在被广泛接受作为晚期胰腺癌化疗的标准用药,但是吉西他滨在临床应用中也存在许多不足,比如：耐药性、毒副作用等等,中药单体大黄素（Emodin, EMO）是一种葸醌类物质,研究发现,大黄素能抑制多种恶性肿瘤细胞生长并诱导凋亡,如肝癌、肺癌、乳腺癌,宫颈癌和白血病等,为此本课题将对大黄素抗胰腺癌的作用及其机制进行研究,将为大黄素联合吉西他滨治疗胰腺癌的临床应用提供客观而科学的理论基础和实验依据,并为胰腺癌的临床治疗提供一种新的有效药物和优选方案,从而为胰腺癌的临床治疗开辟新的有效途径。本课题研究内容分三部分。第一部分大黄素对人胰腺癌细胞株SW1990的生物学效应及其作用机制目的1、观察大黄素对人胰腺癌细胞株SW1990的生物学效应；2、探讨大黄素诱导人胰腺癌SW1990凋亡的作用机制。方法1、在体外,将人胰腺癌SW1990细胞暴露于不同浓度的大黄素（10μM,20μM、40μM、80μM）中,观察大黄素对人胰腺癌SW1990细胞形态学的影响,以CCK-8法检测大黄素、及大黄素联合吉西他滨对SW1990细胞增殖的影响,以流式细胞术观察大黄素、及大黄素联合吉西他滨对SW1990细胞凋亡的影响；2、在体外,以EMSA法检测大黄素、吉西他滨分别单独及联合作用SW1990细胞48小时后NF-κB转录活性表达的影响,并以Western Blot法检测SW1990细胞中凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Survivin、Pro-Caspase 3、8、9的变化情况,以进一步明确大黄素诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡的作用机制。结果1、在体外,大黄素能显著抑制人胰腺癌细胞增殖,不同浓度大黄素(10μM、20μM、40μM、80μM作用SW1990细胞24 h后细胞存活率分别为85%、80%、65%和56%,呈明显浓度依赖性（*P<0.05）; 40μM大黄素处理12 h、24 h、48 h和72 h后,SW1990细胞存活率分别为88%、67%、47%和35%,呈时间依赖性（*P<0.05）；大黄素（40μM）联合吉西他滨（20μM）作用72 h后细胞存活率仅为22.62%,相对吉西他滨组（30.78%）有显著差异（*P<0.05）；大黄素作用后的SW1990细胞呈现细胞凋亡的典型表现,Annexin V联合PI法染色结果进一步明确了大黄素的促凋亡作用,且该作用具有药物剂量依赖性；2、大黄素（40μM）、吉西他滨（20μ.M）分别单独或联合用药作用于SW1990细胞48 h后,与对照组相比较,大黄素单药或联合吉西他滨可显著抑制NF-κB活性在胰腺癌SW1990细胞中的表达,而吉西他滨治疗组可明显上调NF-κB活性在胰腺癌SW1990细胞中的表达；大黄素（40μM）、吉西他滨（20μM）分别单独或联合用药作用于SW1990细胞48 h后,大黄素或联合吉西他滨可以明显抑制Bcl-2、Survivin的表达,但可以显著上调Bax的表达,从而也降低了Bcl-2/Bax的比值,且能明显抑制Pro-caspase3、8、9的表达。第二部分大黄素对胰腺癌裸鼠SW1990细胞移植瘤的抑瘤作用及机制目的探讨大黄素是否能增强吉西他滨对裸鼠SW1990细胞移植瘤的抑瘤作用及其可能的机制。方法48只裸鼠接种SW1990胰腺癌细胞,三周后,待所有的裸鼠种植瘤长径均达≥5 mm后将荷瘤鼠用随机区组设计分成4个组,每组12只：生理盐水组（N组）,大黄素组（E组：40 mg/kg）,吉西他滨组（G组：125 mg/kg）,联合用药组（E+G组：大黄素40 mg/kg+吉西他滨80 mg/kg）。各组均采取腹腔注射药物,三天一次,前后共11次。观察各组用药过程中肿瘤体积的变化,末次用药后一周进行活体荧光显像检测肿瘤变化,处死裸鼠后取肿瘤组织测出体积后存放于液氮中,采用透射电镜观察肿瘤组织线粒体的变化；采用Tunel法检测各组肿瘤组织凋亡情况；采用免疫组织化学染色法和Western Blot法检测肿瘤组织Bax、Bcl-2、Active Caspase-9、Active Caspase-3、NF-κB （p65）釉p-Akt的表达水平以及CytochromeC的释放情况；通过凝胶电泳迁移分析（EMSA）检测NF-κB与DNA结合活性的改变。结果末次用药后一周E+G组肿瘤体积明显小于其他各组。活体荧光显像显示与对照组相比,大黄素治疗组肿瘤的个数减少,体积减小,联合组治疗效果更明显。肿瘤组织细胞透射电镜超微结构观察所见,N组线粒体常见,形态较规则,结构良好,基质均匀,线粒体嵴完整；E组部分细胞线粒体肿胀,大小不一致,基质不均,线粒体嵴较对照组和G组稀少,部分嵴有断裂；G组细胞线粒体较E组完整,可见某些线粒体肿胀,基质不均,嵴发育不良；E+G组线粒体大小不一,分布不均,基质不均匀,线粒体嵴发育不良且分布不均,并可见线粒体膜破裂。Tunel法显示E+G组肿瘤细胞凋亡比其余各组显著增多。免疫组织化学染色和Western Blot法显示E+G组的Bax、胞浆Cytochrome C、Active Caspase-9釉Active Caspase-3的表达比其他各组显著增多,而p-Akt、NF-κB （p65）和Bcl-2、的表达比N组和G组明显降低,线粒体中Cytochrome C和Bcl-2/Bax的比值较其余各组均显著下降。EMSA结果显示E+G组肿瘤NF-κB活性比N组和G组明显降低；均有显著性差异（*P<0.05）。第三部分大黄素对胰腺癌转移及血管生成的影响及机制目的1、观察大黄素对胰腺癌转移的影响；2、观察大黄素对胰腺癌血管生成的影响；3、探讨大黄素对胰腺癌转移、血管生成的影响机制。方法采用细胞划痕试验研究不同浓度大黄素（10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L）对胰腺癌SW1990细胞迁移的影响。采用Trans well侵袭实验研究不同浓度大黄素对SW1990细胞侵袭能力的影响。在培养内皮祖细胞（EPCs）的基础上,通过体内Matrigel plug法血管抑制实验研究大黄素对体内血管生成的影响。制作裸鼠胰腺癌原位移植模型,将裸鼠随机分为四组,术后第3周开始给药,对照组每只腹腔注射生理盐水0.2 mL；吉西他滨（100 mg/kg）腹腔注射；大黄素（50 mg/kg）灌胃；联合组为吉西他滨（80 mg/kg）腹腔注射联合大黄素（50 mg/kg）灌胃。各组均为每周给药3次,共治疗两周。用药后4周末应用MicroPET对裸鼠进行扫描,处死裸鼠后测定瘤体重量,留取胰腺肿瘤、肠、肝脏、腹壁和肾,标本连续切片,HE染色,确定转移范围。通过肿瘤血管成像研究大黄素对胰腺癌血管生成的影响。免疫组化法检测大黄素、吉西他滨和大黄素联合吉西他滨对原位移植瘤组织中微血管内皮细胞标记物CD31、CD34和血管生成相关因子（VEGF、MMP-2、MMP-9釉Survivin）的影响。Western Blot法检测大黄素、吉西他滨和大黄素联合吉西他滨对原位移植瘤组织中血管生成相关基因（NF-κB及其调控因子VEGF、MMP-2、MMP-9、eNOS釉Survivin）表达的影响。结果细胞划痕试验显示大黄素组（10μmol/L、20μmol/L釉40μmol/L）抑制胰腺癌细胞迁移,呈浓度依赖性,与对照组相比,差异均有统计学意义（*P<0.05）；Transwell侵袭实验显示大黄素可抑制体外胰腺癌SW1990细胞侵袭,呈浓度依赖性,与对照组相比较,差异均有统计学（*P<0.05）；体内Matrigel plug法血管抑制实验显示：相对于EPCs组,大黄素+EPCs组显著降低Matrigel胶中血红蛋白含量,差异具有统计学意义（*P<0.05）。裸鼠原位移植瘤MicroPET扫描结果表明：吉西他滨和大黄素组的肿瘤/肌肉感兴趣区的比值（ROI）较对照组均有显著性差异（*P<0.05）,联合组（1.55±0.058）较其他各组均有显著性差异（**P<0.05）；吉西他滨组和大黄素组的肿瘤标准摄取值（SUV）较对照组均有显著性差异（*P<0.05）,联合组较其他各组均有显著性差异（**P<0.05）；与对照组相比,大黄素组和吉西他滨组均可明显抑制胰腺原发肿瘤生长（*P<0.05）；另外,与对照组和各单药组相比较,大黄素和吉西他滨联合组可显著抑制胰腺原发肿瘤生长（**P<0.05）。大黄素单独或联合吉西他滨显著抑制胰腺癌转移,不仅转移部位减少,转移灶数目也锐减。肿瘤血管成像显示,大黄素组和联合组肿瘤不仅体积较对照组显著缩小,血管分布较对照组和吉西他滨组也明显减少（*P<0.05）。免疫组化染色结果显示吉西他滨对移植瘤表达CD31+、CD34+、VEGF、MMP-2、MMP-9无明显影响（*P>0.05）,可上调移植瘤表达Survivin （*P< 0.05）,大黄素或大黄素联合吉西他滨可显著下调原位移植瘤组织中CD31、CD34和血管生成相关因子（VEGF、MMP-2、MMP-9和Survivin）的表达（*P<0.05）。Western Blot法结果进一步显示大黄素或大黄素联合吉西他滨可显著下调原位移植瘤组织中NF-κB及其调控因子VEGF、MMP-2、MMP-9、eNOS及Survivin的表达。结论1、大黄素对胰腺癌SW1990细胞的增殖具明显抑制作用,且有剂量和时间依赖性,能明显诱导胰腺癌SW1990细胞凋亡；大黄素联合吉西他滨联合作用时可具有协同增殖抑制和促凋亡作用。2、大黄素可显著抑制SW1990细胞中NF-κB活性及其下游蛋白Bcl-2、Survivin的表达,并上调Bax蛋白,降低Bcl-2/Bax比值,下调Pro-caspase 3、8、9的表达,启动线粒体凋亡途径,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡3、大黄素能显著增强吉西他滨对裸鼠胰腺癌SW1990细胞移植瘤的抑瘤效果,其机制可能是大黄素通过抑制胰腺癌组织中Akt和NF-κB的激活,抑制Bcl-2的表达,并促进Bax的表达,从而降低Bcl-2/Bax的比值,破坏肿瘤细胞线粒体结构及增加线粒体膜通透性,引起线粒体Cytochrome C释放,通过触发Caspase级联反应促使Caspase-9、Caspase-3激活,最终导致其增强吉西他滨对胰腺癌移植瘤的促凋亡作用。4、大黄素可通过抑制胰腺癌血管生成而抑制胰腺癌的生长、转移。5、大黄素抑制胰腺癌血管生成,其机制可能与下调胰腺癌中NF-κB及其调控因子VEGF、MMP-2、MMP-9、eNOS釉Survivin的表达有关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目次
• 序言
• 第一部分 大黄素对人胰腺癌细胞株SW1990的生物学效应及其作用机制
• 1.1 前言
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验方法
• 1.4 结果
• 1.5 讨论
• 1.6 参考文献
• 第二部分 大黄素对胰腺癌裸鼠SW1990细胞移植瘤的抑瘤作用及机制
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 2.4 结果
• 2.5 讨论
• 2.6 参考文献
• 第三部分 大黄素对胰腺癌转移及血管生成的影响及机制
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.3 实验方法
• 3.4 结果
• 3.5 讨论
• 3.6 参考文献
• 结论
• 综述一
• 参考文献
• 综述二
• References
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果