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鳗弧菌（Vibrio anguillarum）M3菌株T6SS基因簇的克隆及其功能的初步研究

2020-12-07阅读(913)

鳗弧菌（Vibrio anguillarum）M3菌株T6SS基因簇的克隆及其功能的初步研究

论文摘要

细菌T6SS分泌系统（Type VI secretion system, T6SS）是最近报道的一个新的蛋白分泌系统。根据鳗弧菌（Vibrio anguillarum）Fosmid文库获得的部分基因组序列信息,发现鳗弧菌存在T6SS分泌系统的同源基因。通过同源克隆、genomic Walking等方法,获得了鳗弧菌M3菌株的T6SS分泌系统基因簇。该基因簇含有22879bp,编码16个ORF,GC含量为46.93%,与V. cholerae有最高相似性,为87%。为了确定鳗弧菌M3的T6SS基因的转录是否受一个操纵子调控,通过跨两个连续基因设计引物进行PCR和生物信息学分析结合的方法,发现在鳗弧菌T6SS基因簇的基因vaa108上游存在一个启动子,来调控M3整个T6SS基因的转录。为了研究T6SS基因的功能,通过In-frame-deletion的方法构建了7个基因的缺失突变株,研究了这些突变株的生长、泳动性、胞外酶产生和毒力等方面的变化。结果表明,在生长方面,4株突变株在在对数生长期的生长速度比野生型菌株显著加快（p<0.05）、1株突变株的生长稍微减慢、2株突变株的生长没有明显变化;在泳动性方面,2株突变株的泳动性增强（P<0.05）,其他突变株则没有显著变化;1株突变株的α-葡萄糖苷酶活性明显高于野生株。以突变株对蓝曼龙鱼（Trichoqaster trichopterus）进行攻毒检测半数致死量（LD50）,结果发现有4株突变株的毒力没有明显变化或变化不明显,3株突变株的毒力37223倍。这些结果表明,鳗弧菌T6SS可能参与了细菌的毒力。生物信息学分析发现,鳗弧菌基因簇内命名为vaa117的基因编码sigma 54转录调节因子。研究发现,vaa117基因缺失突变后,鳗弧菌菌膜形成能力有明显变化,在48-72h菌膜形成不仅快于野生型菌株,而且菌膜形成量也高于野生型。表明鳗弧菌的菌膜形成受到vaa117基因的负调控。进一步研究发现,vaa117基因缺失突变后,鳗弧菌溶血素共调蛋白（hemolysi-coregulated protein）基因hcp mRNA的表达效率只有野生型的7.44%。表明vaa117基因对hcp的表达为正调控。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章文献综述
  • 引言
  • 1. 病原性细菌致病机制
  • 1.1 病原菌的致病性
  • 1.2 病原菌的一般致病机制
  • 2. 细菌的分泌系统
  • 2.1 革兰氏阴性细菌的Ⅰ～Ⅴ型分泌系统
  • 2.2 革兰氏阴性细菌的T6SS
  • 第二章鳗弧菌M3菌株T6SS基因序列的克隆及生物信息学分析
  • 1. 实验材料
  • 1.1 实验用菌株
  • 1.2 实验仪器
  • 1.3 实验试剂
  • 2. 实验方法
  • 2.1 引物设计
  • 2.2 鳗弧菌M3 基因组DNA 的提取
  • 2.3 PCR 扩增
  • 2.4 PCR 产物的胶回收、连接、转化及阳性克隆筛选
  • 2.5 鳗弧菌M3 T6SS 分泌系统操纵子的推测
  • 2.6 生物信息学分析
  • 3. 结果与分析
  • 3.1 鳗弧菌T6SS 分泌系统序列分析
  • 3.2 鳗弧菌T6SS 操纵子结构预测
  • 3.3 编码序列的直系同源体分析
  • 3.4 鳗弧菌VI 系统编码蛋白的功能预测
  • 第三章鳗弧菌T6SS基因缺失突变株的构建、表型特征及毒力检测
  • 1. 实验材料
  • 1.1 实验菌株和动物
  • 1.2 实验仪器
  • 1.3 试剂
  • 2. 实验方法
  • 2.1 鳗弧菌M3 菌株T6SS 部分基因缺失突变株的构建
  • 2.2 鳗弧菌M3 菌株和基因缺失突变株生长曲线的检测
  • 2.3 平板泳动实验
  • 2.4 API ZYM 酶活检测
  • 2.6 vaa117 基因对菌膜（biofilm）形成的影响
  • 50检测'>2.7 LD50检测
  • 3. 结果与讨论
  • 3.1 基因缺失突变株的构建
  • 3.2 鳗弧菌M3 菌株野生型和突变株生长曲线的分析
  • 3.3 平板泳动实验
  • 3.4 API ZYM 酶活检测
  • 3.5 菌膜形成
  • 3.6 感染实验结果
  • 第四章RT-PCR检测VAA117基因对VAA017基因转录的调控
  • 1. 实验材料
  • 1.1 实验菌株
  • 1.2 实验仪器
  • 1.3 试剂
  • 2. 实验方法
  • 2.1 细菌总RNA 的提取
  • 2.2 反转录RNA 合成cDNA
  • 2.3 RNA 质量的检测
  • 2.4 cDNA 质量的检测
  • 2.5 荧光定量PCR
  • 3. 结果与讨论
  • 3.1 RNA 提取质量的检测
  • 3.2 RNA 反转录质量的检测
  • 3.3 定量PCR 反应标准曲线的绘制
  • 3.4 vaa117 基因缺失对hcp 基因转录的影响
  • 参考文献
  • 已发表和已接受的文章
  • 致谢

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