论文摘要
目的乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，其与宫颈癌是妇女中发病率最高的两种恶性肿瘤，也是妇女死亡的主要原因之一。过去十年对乳腺癌的研究从未停止过，但其潜在的发病机制至今尚未完全清楚。乳腺癌是一种特殊的病理状态，癌细胞所表达的蛋白质，无论在种类还是丰度上均与正常乳腺细胞有明显差别。研究者尝试从不同的角度对乳腺癌来源样本进行蛋白质组学分析，从不同“组”对乳腺癌的发病机制进行研究，以尽可能得到与乳腺癌发生发展有关的重要信息。本课题采用差异表达方法对乳腺癌组织与邻近正常组织间差异表达基因与蛋白进行分析，探讨乳腺癌与泛素-蛋白酶体系统的关系，有助于阐明乳腺癌的发病机制，寻找与临床诊断、治疗有关的生物学标记或靶标。材料与方法：材料1．手术切除的新鲜组织，包括癌组织及邻近（＞1.5cm）正常乳腺组织（即组织形态学上相对正常的癌旁乳腺组织），共12例，临床分期：T3N3M1（1例），T3N2M0（1例），T2N3M0（1例），T2N2M0（3例），T2N1M0（4例），T1N2M0（1例），T1N1M0（1例）。病理诊断均为浸润性导管癌。2．RFDD-PCR相关试剂材料与设备，2-DE相关试剂材料与设备，PDQuest 7.1软件，抗PSMD8、PSMD11与UBE3A抗体。方法1．本课题使用总蛋白提取试剂盒（Bio-Rad，CA，USA）提取总蛋白，二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）与基质辅助激光解吸／电离时间飞行串联质谱（MALDI-TOF-TOF MS）技术，以及在线数据库搜寻，对乳腺癌组织与邻近相对正常组织所表达差异蛋白质进行分离鉴定，对结果进行分析讨论。2．使用总RNA试剂盒（WATSON BIOTECHNOLOGIES，中国）提取总RNA，同时使用限制性片段差异显示多聚酶链反应（RFDD-PCR）对泛素-蛋白酶体系统重要组成部分基因表达情况进行观察。3．通过组织切片、免疫组化染色对研究结果进一步观察，证实结果的可靠性。结果经过数据库比对与质谱技术，共有14个差异蛋白被鉴定（＞4倍）。（1） 5个蛋白在乳腺癌组织中表达下调，包括血清白蛋白、免疫球蛋白重链γ、α1抗胰蛋白酶、载脂蛋白A-I与免疫球蛋白轻链，这五种蛋白主要为血浆蛋白，其中α1抗胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，α1抗胰蛋白酶的缺乏可导致循环系统及呼吸系统疾病；（2） 3个蛋白在乳腺癌组织中表达可能上调，包括超氧化物歧化酶、甲状腺激素结合蛋白Transthyretin与Transgelin 2；（3） 6个蛋白在乳腺癌组织中表达上调，包括：延长因子1-β与核糖体蛋白S12，与组织蛋白合成有关的蛋白质；组织蛋白酶D、小泛素相关修饰因子3前体与蛋白酶体α1亚单位，与蛋白降解有关的酶；翻译控制肿瘤蛋白，与癌细胞转移有关的蛋白。通过限制性片段差异显示多聚酶链反应（RFDD-PCR）对泛素-蛋白酶体系统组成部分进行观察，结果发现5个蛋白酶体亚单位基因（PSMB5、PSMD1、PSMD2、PSMD8与PSMD11）、4个泛素特异蛋白酶基因（USP9X、USP9Y、USP10与USP25）及1个泛素蛋白连接酶E3A基因（UBE3A）在乳腺癌组织中表达上调（＞3倍）。免疫组化结果证实PSMD8、PSMD11与UBE3A在乳腺癌细胞内表达上调（＞3倍）。结论本研究通过2-DE与质谱技术，并辅助蛋白质组数据库搜寻比对方法对正常乳腺与乳腺癌差异表达蛋白进行分析，结果证实乳腺癌的病理改变与物质代谢的加强、蛋白溶解活动的提升及一些酶抑制因子活性降低有关。乳腺癌病理过程中常伴随着组织蛋白表达的变化，其中一些蛋白表达上调可能是与临床诊断、治疗及预后有关的生物标记，如α1抗胰蛋白酶、延长因子1-β、组织蛋白酶D、翻译控制肿瘤蛋白、小泛素相关修饰因子3前体、核糖体蛋白S12及蛋白酶体α1亚单位，而小泛素相关修饰因子3前体、核糖体蛋白S12及蛋白酶体α1亚单位在乳腺癌组织中表达上调尚未见其它文献报道。本研究使用RFDD-PCR及2-DE为基础的蛋白质组学方法对泛素-蛋白酶体系统组成部分进行观察，发现乳腺癌组织中该系统许多重要组成部分在基因水平及蛋白质水平表达均上调，免疫组化也证实PSMD8、PSMD11及UBE3A在乳腺癌组织表达上调，结果提示乳腺癌中泛素-蛋白酶体系统泛素化、蛋白酶体降解及去泛素化活动均明显加强，提示乳腺癌的发生发展可能与泛素-蛋白酶体系统多环节、多步聚功能改变有关。但由于该系统各个部分靶蛋白不明，作用机制也比较复杂，因此大量而细致的相关研究还有待于进一步深入。本研究在整体上对正常乳腺与乳腺癌组织间差异表达基因及蛋白质进行观察分析，可为进一步的基础与临床研究提供新的思路与重要的实验依据。
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