热休克蛋白在煤工尘肺、COPD及肺癌患者表达及其可能作用

论文摘要

煤矿粉尘是我国最严重的职业危害因素之一。长期接触煤矿粉尘不但引起煤工尘肺，还可使煤工慢性阻塞性肺病（COPD）的发病率增加。氧化应激损伤在煤工尘肺及COPD的发病机制中起重要作用。肺泡巨噬细胞在吞噬粉尘过程中产生大量活性氧族（ROS），并释放多种蛋白酶类及致炎症，致纤维化细胞因子，引起持续性气道、肺泡炎症及成纤维细胞增生，还可导致DNA氧化损伤，基因突变，增加患恶性肿瘤的危险性。粉尘致病的多个环节均有免疫反应参与，煤工尘肺病人血浆中可出现多种自身抗体或合并自身免疫性疾病。总之，粉尘致病机制十分复杂，涉及多种细胞及生物活性物质，甚至在停止粉尘接触后，尘肺病变仍可继续进展。诱导合成热休克蛋白（Hsps）是各种生物（包括哺乳类）清除细胞内变性蛋白质的重要细胞保护机制之一。Hsps广泛存在于原核及真核生物细胞中，其分子结构在进化上高度保守。多种环境应激（包括包括氧化应激）均可诱导Hsps表达。Hsps的主要功能包括：1．作为分子伴侣，帮助新合成的蛋白质正确折叠及跨膜转运，参与细胞生长、分化及凋亡；2．在应激情况下，与损伤变性蛋白质结合，使其重新正确折叠或降解，促进损伤蛋白质修复。亚致死性环境应激诱导Hsps表达增加可提高细胞对进一步致死性应激的抵抗力（称为应激耐受）。3．表达干细胞表面或释放入细胞外液的Hsps可作为自身抗原，刺激机体产生抗体，并与自身及外来抗原肽结合，将其递呈给抗原递呈细胞，参与并调节免疫反应，还可抑制炎性细胞因子释放。Hsps分子结构的高度保守性与对环境变化的敏感性，使其有可能作为早期广谱的应激反应生物标志，成为预测环境应激的有效方法。煤矿粉尘相关性肺病的发生发展是基因与环境因素相互作用的结果，Hsps可能在煤矿粉尘致病机制中起重要作用。但目前此方面的研究尚很少见，因此，本研究以煤工尘肺、COPD及肺癌患者为研究对象，以重要诱导性、组分性表达的Hsps（Hsp27、Hsp70及Hsc70）为研究重点，结合煤工累积接尘量、肺功能等指标，探讨应激蛋白表达在煤矿粉尘致病机制中的可能作用，及与煤工累积接尘水平、肺功能改变之间的联系。本研可能是探讨应激反应与煤矿粉尘相关性肺病关系的新尝试。第一部分健康煤工淋巴细胞对BPDE的反应能力生物组织细胞经常面临各种环境应激，导致细胞内变性蛋白质聚积，诱发机体保护性反应，即合成Hsps。老化、慢性持续环境刺激与疾病等可使机体应激能力减退，不能增加Hsps表达以抵抗进一步环境应激，加重组织细胞损伤，甚至导致死亡。职业性接触煤矿粉尘即属于一种慢性持续环境应激，接尘工人长期暴露于粉尘环境中，可能影响机体应激反应能力，增加某些职业相关性肺疾病（如煤工尘肺、COPD及肺癌）发病危险性。本部分研究通过对比观察健康煤工与普通健康男性外周血淋巴细胞对BPDE[苯并（a）芘二羟环氧化物]刺激的反应能力（以Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平为指标），评价慢性粉尘环境应激对健康煤工机体应激反应能力的影响。本研究包括75名健康煤工（均为男性，年龄范围47-83岁）及42名健康男性公民（无粉尘接触史，年龄范围45-80岁）。采集研究对象职业史、吸烟史等信息，测定肺通气功能[包括肺活量（VC）、第一秒最大呼气率(FEV1.0％Pre)]。煤工个体累积接尘量，据工种、工作面平均呼吸性粉尘浓度及工作年限估算。用流式细胞术测定研究对象外周血淋巴细胞基础及BPDE作用后，Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平。用Independent T-test比较组间差异；用多变量相关分析探讨健康煤工淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsp70表达与年龄、吸烟指数、累积接尘量及肺功能指标之间的关系，计算变量间的Pearson相关系数。结果显示，两组研究对象外周血淋巴细胞基础Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平无显著差异。健康非煤工组外周血淋巴细BPDE作用后Hsp27、Hsc70表达明显下调，Hsp70表达明显上调，与基础水平比较差异有显著至高度显著统计学意义（Hsp27：23.73±4.78 Vs 20.32±5.20，P＜0.05；Hsc70：26.11±9.69 vs 12.91±1.04，P＜0.01；Hsp70：21.67±5.19 vs 25.57±5.81，P＜0.01）；但健康煤工组外周血淋巴细胞BPDE作用后，Hsp27、Hsp70和Hsc70表达与基础水平比较仍无显著差异。健康煤工外周血淋巴细胞基础Hsp27表达水平与其累积接尘量之间呈高度显著正相关（r=0.517，P＜0.01）。此结果表明，长期接触煤矿粉尘的健康煤工，其淋巴细胞对进一步应激的反应能力明显减弱，不能相应改变Hsps表达，以对抗有害环境刺激。提示健康煤工机体已存在应激能力减退，而且应激能力减退可能增加其罹患煤矿粉尘相关性肺病的危险。健康煤工淋巴细胞Hsp27表达水平与累积粉尘暴露量之间的正相关关系，提示Hsp27可能对判断煤工累积接尘水平与机体应激能力有重要价值。第二部分煤工尘肺、COPD及肺癌患者淋巴细胞Hsps表达及意义第一节煤工尘肺患者淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达及意义煤尘刺激可导致持续性肺泡炎症及肺间质纤维化，氧化应激损伤在煤工尘肺发病机制中起重要作用。肺泡巨噬细胞在吞噬粉尘颗粒过程中发生氧化爆发，产生大量ROS并释放多种炎性及纤维化细胞因子。Hsp27、HSP70具有很强抗氧化损伤功能，可减少ROS生成。Hsp27、HSP70还可刺激单核细胞释放具有免疫抑制作用的细胞因子，抑制免疫炎性反应，减少TNF-α及ROS等介导的细胞溶解或凋亡。Hsps的分子伴侣及免疫调节功能可能对减轻或抑制粉尘毒性有重要作用。因此，我们用流式细胞仪检测并比较了75名健康煤工（年龄范围47-83岁）及52名煤工尘肺患者（年龄范围48-77岁）外周血淋巴细胞基础Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平，用多因素Binary Logistic回归模型分析了淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平与煤工尘肺的关系。结果显示，煤工尘肺患者外周血淋巴细胞Hsp27表达水平明显高于健康煤工组（31.17±11.76 vs 21.20±8.07，P＜0.01），但两组Hsp70和Hsc70表达水平无显著差异。多因素Binary Logistic回归分析也显示，Hsp27表达与煤工尘肺患病密切相关（调整的OR=10.870，95％可信区间：4.255-27.778，P＜0.01）。煤工尘肺组中，Hsp27表达上调人数（＞中位数值）占76.92％（40／52），而健康煤工组Hsp27表达上调人数只占29.33％（22／75），两组比较有显著差异（x2=27.84，P＜0.01）（Crosstabs analysis Chi-square tests）。上述结果提示，Hsp27表达上调可能是煤工尘肺患者机体对抗慢性缺氧应激的重要代偿机制，对延缓煤工尘肺的进程有重要意义。慢性粉尘应激过程中，机体无力通过长期高水平表达Hsp70对抗环境应激，不能有效增加Hsp70表达也提示煤工尘肺患者机体应激能力减退的标志。联合监测Hsp27、Hsp70和Hsc70对判断煤工应激水平与煤工尘肺患病危险可能更有意义。第二节煤工COPD患者淋巴细胞Hsps表达特点及与疾病关系除煤工尘肺外，COPD也是煤矿粉尘接触引起的最常见疾病之一。煤尘引起的氧化应激损伤在COPD气道炎症过程中起重要作用。但在同等粉尘暴露水平，有的煤工罹患尘肺，有的患COPD，说明两种疾病的发病机制有联系又有区别，个体反应性可能也有一定影响。Hsps做为分子伴侣对维持细胞的正常生理功能及抗氧化应激损伤有重要作用，煤工尘肺与COPD患者抗氧化损伤的能力可能不同，其细胞内Hsps的表达水平、种类也可能有差异。本研究测定了55例煤工COPD患者及75例健康煤工外周血淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平。用Independent Student’s T-test比较两组煤工Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平的差异，多因素Binary Logistic回归模型分析外周血淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平、累积接尘量、吸烟指数及年龄与COPD的关系。结果发现，与健康煤工组比较，煤工COPD患者外周血淋巴细胞Hsp27、Hsc70表达均明显升高（Hsp27：21.20±8.07 vs 32.47±14.92，P＜0.01；Hsc70：24.24±8.07 vs 30.30±11.63，P＜0.01）；两组Hsp70表达无显著差异。多因素BinaryLogistic回归分析显示，累积接尘量、Hsp27与Hsc70表达水平与煤工COPD患病密切相关（Hsp27：调整的OR值为2.604，95％CI∶1.168-5.814，P＜0.05；Hsc70：调整的OR值为2.326，95％CI∶1.005-5.376，P＜0.05）。煤工COPD组中，Hsp27表达上调人数（＞中位数值：20.50）占63.64％（35／55）明显高于健康煤工组（34.67％），两组比较有高度显著差异（x2=10.69，P＜0.01）；Hsc70表达上调人数（＞中位数值：25.00）占60.00％（33／55）明显高于健康煤工组（41.33％），两组比较有显著差异（x2=4.42，P＜0.05）；Hsp27与Hsc70表达均上调人数占43.64％（24／55），也明显高于健康煤工组（17.33％）（x2=10.78，P＜0.01）（Crosstabs analysis Chi-Squaretests）。通过本研究我们发现，Hsp27和Hsc70表达升高，对保护COPD患者机体细胞，对抗慢性缺氧损伤有重要意义。煤工COPD与尘肺患者，处于同等累积接尘水平，但粉尘作用的后果不同，机体应激蛋白异常表达的类型也有差异，提示特定的应激蛋白表达类型，可能反映特定的疾病状态或环境因素。第三节淋巴细胞Hsps表达与煤工肺癌的关系氧化应激损伤是粉尘致肺纤维化及致癌发病过程的一个共同机制，可导致DNA氧化损伤、基因突变，进而诱发细胞恶性转化。Hsps在抗氧化损伤及抗肿瘤免疫中起重要作用，但还可从不同位点抑制细胞凋亡信号传导，与肿瘤的发生、转移及药物抵抗有关。几乎各种人类肿瘤中都有Hsp27、Hsp70的异常表达，同时由于对环境变化的高度敏感性，Hsp27、Hsp70可能在环境相关性肿瘤的发病中有特殊意义。煤工肺癌患者均有长期粉尘接触史，粉尘毒性可削弱机体应激能力，增加罹换患肺癌危险。本部分研究通过比较煤工肺癌患者与健康煤工外周静脉血淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平，探讨Hsps在煤工肺癌发病机制中的可能作用。研究对象包括51例男性煤工肺癌患者和75例健康煤工。用流式细胞仪测定两组煤工外周血淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平。用IndependentStudent’s t-test及多因素Binary Logistic回归模型分析外周血淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达水平、粉尘累积暴露、吸烟指数及年龄与煤工肺癌的关系。结果显示，煤工肺癌患者外周血淋巴细胞Hsp27、Hsp70表达水平明显低于健康煤工（Hsp27：16.89±2.74 vs．21.20±8.07，P＜0.01；Hsp70：17.87±4.62 Vs．20.68±8.21，P＜0.05）；两组Hsc70表达无显著差异。多因素Binary Logistic回归分析显示，外周血淋巴细胞Hsp27表达水平、累积接煤尘量及吸烟指数均与煤工肺癌密切相关（其中Hsp27表达水平降低（＜中位数值：17.85），调整的OR值：4.729，95％CI：1.789-12.503，P＜0.01）。Hsp27表达降低的煤工（＜中位数值），罹患肺癌危险比高表达Hsp27煤工（＞中位数值）高3.73倍。上述结果提示，Hsp27、Hsp70表达下调可能作为预测煤工肺癌患者体内分子伴侣负荷过重与应激能力明显减退的双重生物标志。第三部分煤工尘肺及肺癌患者血浆Hsp27、Hsp70的生物学意义某些病理情况下，Hsps可表达于细胞表面或释放到血循环及其它浆膜腔液中。推测Hsps释放到细胞外的机制有主动分泌与漏出两种方式，前者可能为满足细胞外液蛋白质对分子伴侣的需求增加，后者可能是细胞损伤，坏死的结果。血浆Hsps水平可能反映细胞内Hsps水平，但也可能反映细胞膜损伤的程度。因此，区别血浆Hsps的来源，对正确理解其功能十分重要。血浆Hsp27、Hsp70的水平可能与煤工尘肺及肺癌的发生发展有关。我们从前述健康煤工组，煤工尘肺及肺癌患者组中各随机抽取一部分研究对象，比较各组间血浆Hsp27、Hsp70水平差异及淋巴细胞内与血浆Hsp27、Hsp70水平的关联，以探讨血浆Hsps在煤工尘肺及肺癌发病机制中的可能作用。研究对象包括38例健康煤工、50例煤工肺癌及55例煤工尘肺患者。用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血浆中Hsp27、Hsp70水平。用多变量相关分析及多因素BinaryLogistic回归模型分析年龄、吸烟、累积接尘量及血浆Hsp27、Hsp70表达水平与煤工尘肺及肺癌的关系，计算Pearson相关系数及OR值。结果显示，三组煤工血浆Hsp70与Hsp27水平变化呈相反趋势，健康煤工组血浆Hsp27水平明显高于煤工肺癌与煤工尘肺组（199.33±86.79 vs144.50±79.29，P＜0.01和199.33±86.79 vs 63.61±60.51，P＜0.01），煤工肺癌组血浆Hsp27水平又明显高于煤工尘肺组（144.50±79.29 vs 63.61±60.51，P＜0.01）；但健康煤工组血浆Hsp70水平明显低于煤工尘肺组（3.09±5.22 vs 90.71±103.09，P＜0.01），也低于煤工肺癌组（虽差异未达到显著统计学意义）。三组煤工血浆Hsp27、Hsp70水平与年龄、累积接尘量、吸烟指数、肺功能指标之间均无明显关系。各组血浆与细胞内Hsp27、Hsp70水平之间也多无明显关系。多因素BinaryLogistic回归分析显示，血浆Hsp27水平与煤工肺癌患病有关（调整的OR值为3.513，95％CI：1.223-10.092，P＜0.05），血浆Hsp27降低的煤工（＜中位数值：150.80），患肺癌危险比血浆Hsp27水增加的煤工（＞中位数值）高2.51倍。血浆Hsp27及Hsp70水平均与煤工尘肺患病有关（血浆Hsp27降低（＜中位数值：98.03）调整的OR=8.772，95％CI：2.141-35.714，P＜0.01；血浆Hsp70升高（＞中位数值：11.31）：调整的OR=25.000，95％CI：5.556-111.111，P＜0.01）。血浆Hsp27水平降低的煤工（＜中位数值），患尘肺危险比血浆Hsp27增加煤工（＞中位数值）高7.77倍；而血浆Hsp70水平升高的煤工（＞中位数值），患尘肺危险比血浆Hsp70降低煤工(＜中位数值1高24.00倍。以上结果提示，血浆Hsp27水平升高，可能主要起保护作用，Hsp70水平升高则可能是煤工罹患尘肺及肺癌危性险增加的信号；血浆Hsp27水平也可作为粉尘接触的生物标志。但血浆Hsp27、Hsp70水平与年龄、累积接尘量、吸烟指数及肺功能指标之间均无显著相关，说明对血浆Hsps的生物学意义需进一步研究探讨。结论本研究用流式细胞术及酶联免疫吸附法分别检测了健康煤工、煤工尘肺、COPD及煤工肺癌患者外周血淋巴细胞内Hsp27、Hsp70和Hsc70及血浆中Hsp27、Hsp70的表达水平，用Independent Student’s t-test及多因素Binary Logistic回归模型等分析了外周血淋巴细胞内Hsp27、Hsp70和Hsc70及血浆Hsp27、Hsp70表达与煤工尘肺、COPD及煤工肺癌之间的关系，探讨了煤工尘肺、COPD及煤工肺癌患者淋巴细胞内及血浆中几种重要Hsps的表达特点，所得主要结论如下：1．健康煤工机体已存在潜在的应激能力减退。表现为其淋巴细胞对BPDE作用的应激反应能力明显降低，不能相应增加Hsps表达以抵抗进一步环境应激。应激能力减退可能增加煤工罹患煤矿粉尘相关性肺疾病的危险。2．健康煤工外周血淋巴细胞Hsp27表达水平与其累积接尘量之间呈显著正相关，提示Hsp27可能对评价煤工累积粉尘接触水平有一定价值。3．应激蛋白表达类型差异，可反映机体患不同疾病或不同环境因素作用。煤工COPD、尘肺及肺癌患者累积接尘水平相似，但粉尘作用后果不同，Hsps表达异常类型也有差异。煤工尘肺患者淋巴细胞Hsp27表达上调，煤工COPD患者Hsp27、Hsc70表达均上调，而煤工肺癌患者Hsp27、Hsp70表达均下调。提示应激蛋白表达在一定程度上反，映了不同煤矿粉尘相关性肺病发病机制的差别，及机体应激能力对疾病发生发展的影响。监测多种Hsps可以弥补一种Hsps的局限性，提高Hsps对评价环境应激的敏感性和效能。4．本研究进一步证实应激诱导型Hsps（Hsp70）表达上调是急性环境应激的标志。慢性疾病患者，持续表达型Hsps的分子伴侣作用，对清除体内缓慢积聚的变性蛋白质可能更为重要。因此，Hsp70水平不升高或降低可能是长期持续环境有害因素作用或慢性疾病的信号。5．与健康煤工比较，煤工尘肺及肺癌患者血浆Hsp27水平降低，Hsp70水平增加，提示Hsp27可能主要起细胞保护作用，而Hsp70是细胞损伤加重的标志。但血浆与细胞内Hsps水平之间无明显联系，说明煤工尘肺与肺癌患者血浆Hsps来源较复杂，其生物学意义还需进一步研究探讨。

论文目录

• 英文缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 健康煤工淋巴细胞对 BPDE的反应能力
• 1. 研究对象与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二部分 煤工尘肺、COPD及肺癌患者外周血淋巴细胞 Hsps表达及意义
• 第一节 煤工尘肺患者淋巴细胞Hsp27、Hsp70和Hsc70表达及意义
• 1. 研究对象与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第二节 煤工COPD患者淋巴细胞Hsps表达特点及与疾病关系
• 1. 研究对象与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三节 淋巴细胞Hsps表达与煤工肺癌的关系
• 1. 研究对象和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 第三部分 煤工肺癌与尘肺患者血浆 Hsp27、Hsp70的生物学意义
• 1. 研究对象和方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述:热休克蛋白在环境监测中的应用
• 博士研究生期间工作小结
• 致谢