同种异体胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植治疗糖尿病

论文摘要

目的:通过分离、纯化大鼠的胰岛及胰腺导管上皮细胞,并在体外一定条件下培养,使胰腺导管上皮细胞扩增、转分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛细胞,将胰岛及诱导分化2周的胰腺导管上皮细胞来源的胰岛样结构序贯移植到药物诱导的糖尿病大鼠体内,观察糖尿病大鼠的血糖及生存情况来探讨胰岛及胰腺导管上皮细胞来源的胰岛样结构序贯移植治疗糖尿病的可能性并为将此方法用于临床提供实验依据。方法:将大鼠胰腺组织以胶原酶V消化,然后用非连续性密度梯度离心法将胰腺外分泌细胞、导管上皮细胞和胰岛分离纯化,导管上皮细胞即具有转分化潜能的胰腺干细胞,在体外经CMRL1066及不含血清的DMEM/F12加多种营养因子的培养液中培养27d。于培养的不同时间点（1,3,5,7,14,21,27d）取细胞作PDX-1、CK-19等单抗的免疫组化染色,光镜和电镜观察不同时间点的细胞形态学变化。按照60mg/kg腹腔注射链脲佐菌素（STZ）,选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。采用完全随机法将已成模的糖尿病大鼠分为3组:A组:胰岛移植组13只,肾被膜下植入新鲜大鼠胰岛（200±50个）;B组:胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植组13只,肾被膜下植入新鲜大鼠胰岛（200±50个）及胰腺干细胞来源的胰岛样结构约2×106个;C组:糖尿病对照组10只,肾被膜下植入培养液。3组大鼠均于移植前及移植后48h测空腹血糖浓度,之后每天经尾静脉采血测空腹血糖观察生存情况。结果:通过分离纯化平均每只大鼠可获得100±50个胰岛及大量胰腺导管上皮细胞。体外培养时光镜下胰腺干细胞在培养后第1d即贴壁生长。培养5d内,贴壁细胞迅速扩增为鹅卵石样小细胞片、大细胞片进而分裂增殖成单层细胞。细胞培养第7d,鹅卵石样细胞片迅速扩大,胰岛样芽团开始从细胞片或单层细胞的中央或边缘出现。培养第21到27d,大量较成熟的胰岛样结构出现,双硫腙染色呈强阳性。细胞培养第7d,几乎所有细胞表面均可见短粗的微绒毛及细胞间较致密的连接复合体。第15d,部分细胞的短粗微绒毛消失,细胞内出现大小不等且密度不均的颗粒,其周围可见较多的中间丝。第27d,部分细胞内出现密度较高的颗粒,另有部分细胞内有较多具有低密度晕环的颗粒,大量含颗粒的细胞连接成片,中间丝基本消失。免疫组织化学染色显示:细胞培养第1d,6孔玻板中的部分细胞呈CK-l9抗体染色强阳性。大部分细胞呈PDX-l抗体染色阳性,部分呈强阳性,部分呈弱阳性,少数细胞为阴性。第7d起,可见胰岛样细胞芽团出现并逐渐增多,绝大多数细胞集落和胰岛样细胞芽团均为CK-19强阳性。14d至27d,胰岛样细胞芽团不断增大,PDX-l抗体染色呈强阳性。移植前3组大鼠的血糖均在16.7mmol/L以上,胰岛移植组和胰岛+胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植组在移植后1周内测血糖浓度均有所降低,序贯移植组降低的幅度较胰岛组大,但仍高于10mmol/L。第2周后两组的血糖浓度均降低到10mmol/L以下,序贯移植组大鼠的血糖均低于胰岛移植组。第3周后胰岛移植组的血糖开始上升逐渐升高到移植前的血糖水平,而序贯移植组的血糖则维持到5mmol/L水平。糖尿病对照组大鼠血糖浓度始终在16.7mmol/L以上,无一血糖下降。结论:通过分离、纯化可以获得大量的新鲜胰岛和胰腺导管上皮细胞,大鼠的胰腺导管上皮细胞具有干细胞潜能,在合适的培养条件下早期即能够转分化为PDX-1阳性的胰腺干细胞。胰腺干细胞体外可诱导分化为分泌胰岛素的胰岛样结构,胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植可有效地纠正糖代谢紊乱对大鼠糖尿病有治疗作用。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾（一）
• 文献回顾（二）
• 文献回顾（三）
• 正文
• 第一部分 大鼠胰岛及胰腺干细胞的分离、纯化、培养及鉴定
• 1 材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试剂配制
• 1.4 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠胰岛及胰腺干细胞的分离和培养
• 2.2 倒置显微镜观察细胞形态变化
• 2.3 电镜观察细胞形态变化
• 2.4 免疫组织化学检测PDX-1 及CK-19 表达
• 3 结果与分析
• 3.1 光镜观察
• 3.2 电镜观察
• 3.3 免疫组织化学
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 同种异体大鼠胰岛及胰腺干细胞来源的胰岛样结构序贯移植治疗糖尿病的实验研究
• 1 材料
• 1.1 实验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 试剂配制
• 1.4 实验动物
• 2 实验方法
• 2.1 大鼠胰岛及胰腺干细胞的分离、培养和鉴定
• 2.2 葡萄糖刺激实验胰岛素、C肽分泌量测定（放免法）
• 2.3 免疫细胞化学检测胰岛素的表达
• 2.4 大鼠糖尿病模型制备及动物分组
• 2.5 细胞移植实验
• 2.6 移植术后观察指标
• 2.7 统计学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 葡萄糖刺激实验胰岛素、C肽分泌量测定
• 3.2 免疫细胞化学染色
• 3.3 移植后糖尿病大鼠血糖及生存情况的观察
• 4 讨论
• 5 小结
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢