茶氨酸合成相关酶基因的克隆与“新高”梨增殖体系的建立

论文摘要

茶氨酸（又称N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，简称Theanine）是茶中特有的氨基酸，不仅影响着茶的滋味，而且还具有重要的生物活性，如降血压、抗癌、增强抗肿瘤药物的疗效、保护神经、镇静安神、提高学习和记忆能力和抗疲劳的功效。本试验克隆了茶氨酸合成相关的酶基因，同时建立了“新高”梨的增殖体系，为人工培育茶氨酸梨提供研究基础。1、本试验利用cDNA末端快速扩增技术扩增茶氨酸合成相关酶基因的3’端，设定了如下扩增体系：模板cDNA100ng，10×Buffer（Mg2+p lus）5μl，2.5mmol/L dNTPs8μl，10μmol/L特异性引物GSP47-1（第二轮为GSP47-2）1μl、10μmol/L接头引物UPM （第二轮为NUP）1μl，L ATaq DNA聚合酶2.5U，总体积50μl。扩增程序为：94℃3min；94℃30s；70℃45s；72℃80s，14个循环，-0.5℃/cycle；94℃30s；63℃45s；72℃80s，25个循环；72℃延伸10min。在此基础上克隆出长度约为2.4kb的序列。将该序列与GenBank上已知序列比对，发现与葡萄的谷氨酸氨连接酶的核苷酸序列的相似度达81%。2、反向PCR技术（IPCR）是对已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究的方法。本试验应用IPCR方法克隆茶氨酸合成相关酶基因的启动子序列：即20μl反应液中包含1μg模板、5U限制性内切酶Bsp1407，2μl10×T buffer，2μl0.1%BSA；酶切产物环化自连体系：50μl体系中0.5μg单酶切基因组DNA，5μl10×T4连接缓冲液、5U T4DNA连接酶，22℃连接过夜；IPCR反应体系：50μl体系中约50ng环化自连接产物、2.5μl10×PCR Buffer、25mmol/L Mg2+5μl、10mmol/L dNTPs1μl，10μmol/L引物对（第一轮1S1-1S2，第二轮2S1-2S2）各2ul、1U Taq聚合酶。IPCR扩增程式为：94℃3min，94℃l min，56℃1min，72℃1min，循环29次；72℃延伸7min。利用建立的IPCR技术克隆出茶氨酸合成酶基因5’上游长度为171bp的启动子序列，且该序列含有TATA-box，该元件对基因转录的正确起始起着重要的作用。3、本试验以‘新高’梨芽为外植体，研究了不同浓度植物生长调节剂对其离体增殖的影响。结果表明适宜‘新高’梨离体增殖的培养基为1/2MS+6-BA0.5mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+GA30.5mg.L-1，在此培养基上平均增殖系数达到3.3。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 茶氨酸的主要生理功能
• 1.2 茶氨酸合成酶的研究进展
• 1.3 RACE 技术的研究
• 1.4 启动子克隆方法的研究进展
• 1.5 基因克隆与表达的研究进展
• 1.6 梨离体再生体系的研究
• 2 引言
• 2.1 研究目的与意义
• 2.2 研究内容
• 2.2.1 通过 RACE 技术扩增出茶氨酸合成酶基因的 3’端
• 2.2.2 反向 PCR 技术扩增目的基因的启动子序列
• 2.2.3 “新高”梨增殖体系的建立
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 总 RNA 的提取
• 3.2.2 基因组 DNA 的提取
• 3.2.3 RNA 及 DNA 的质量与浓度的检测
• 3.2.4 大肠杆菌 DH5a 感受态细胞的制备及质粒的转化
• 3.2.5 目的产物的回收与纯化
• 3.2.6 回收产物与 pMD18-T 载体的连接
• 3.2.7 引物设计及合成
• 3.2.8 RNA 反转录成 cDNA
• 3.2.9 RACE 技术扩增 3’端
• 3.2.10 PCR 产物的检测
• 3.2.11 IPCR 技术扩增目的基因的启动子序列
• 3.2.12 “新高”梨增值体系的建立
• 4 结果与分析
• 4.1 茶愈伤组织 RNA 检测
• 4.2 茶愈伤组织基因组检测
• 4.3 ACTIN 引物检测 CDNA
• 4.4 RACE 技术扩增 3’端序列
• 4.4.1 利用降落 PCR 扩增目的片段 3’端
• 4.4.2 目的片段的克隆和测序结果
• 4.4.3 目的片段的同源性分析
• 4.5 反向 PCR 克隆目的片段启动子序列
• 4.5.1 目的基因启动子序列的扩增
• 4.5.2 目的基因启动子的分析
• 4.6 “新高”梨增殖体系的建立
• 4.6.1 不同浓度植物生长调节剂 6-BA、IBA、GA3 对外植体增殖状况的影响
• 4.6.2 不同处理的极差分析
• 5 讨论
• 5.1 RACE 技术克隆茶氨酸合成酶基因 3’端可能存在的问题
• 5.2 克隆目的基因启动子过程中可能存在的问题
• 5.3 不同植物生长调节剂对“新高”梨离体增殖的影响
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介