有先兆偏头痛大鼠三叉神经脊束核基因表达谱的实验研究

论文摘要

目的:1.实验观察有先兆偏头痛大鼠三叉神经脊束核基因表达谱的变化,寻找差异基因;2.探讨皮层扩布性抑制（CSD）导致有先兆偏头痛的分子机制。方法:1.有先兆偏头痛动物模型的建立:以雄性SD大鼠6只（体重为220～250g）,随机分为对照组（n=3）、手术组（n=3）两个区组。左侧半球颅骨前囟前3mm、旁2mm及前囟后6mm,旁5mm处,用电钻进行颅骨钻孔,直径约1.8mm,小心操作保证硬脑膜的完整,分别用作电极记录SD的位置和给予氯化钾或者氯化钠刺激的位置。把玻璃暗微电极（灌充以0.5M醋酸钠溶液）经前囟前3mm孔插入皮层表面下1mm;经位于前囟后6mm处的小孔,手术组用微量注射器把1M氯化钾5u1注射到脑皮层下1mm,对照组把1M氯化钠5ul注射到脑皮层下1mm;每隔10min注射1次,连续注射6次。运用Powerlab采样系统,连续记录电活动变化。2.有先兆偏头痛大鼠三叉神经脊束核基因表达谱分析:使用AffymetrixGenome Rat 230 2.0寡核苷酸微阵列芯片对手术组及对照组大鼠三叉神经脊束核基因表达差异进行研究。刺激结束后快速将大鼠断头取出延髓及上颈段（至颈2）,抽提RNA,并使用紫外定量和变性凝胶电泳质检,合成双链cDNA,进行纯化,体外转录合成生物素标记cRNA,纯化、定量和检测,片段化、检测,进行芯片杂交,清洗染色,将芯片放入基因芯片扫描仪3000进行扫描,使用GeneChipoperating software（GCOS）对扫描图像进行处理分析,获得数据。使用SAM软件进行处理筛选出差异基因;使用CB-MAS4.0生物分子功能注释系统（MAS）把挑选出的差异表达基因进行了Pathway和GO的统计分析,分别对差异基因进行了进一步的功能分类。3.有先兆偏头痛三叉神经脊束核变化基因的功能分析:采用实时定量PCR实验的方法对差异基因中的4个进行验证,使用生物信息学方法分析差异基因的功能。综合评价CSD参与有先兆偏头痛的分子生物学机制。结果:1.采用高K+脑皮层微量注射的方法成功诱发CSD,建立有先兆偏头痛模型,与对照组相比,电生理记录图显示高K+注射后出现明显的电信号的抑制和翻转。2.Affymetrix Rat Genome array 230 2.0芯片全基因组31099个转录子中,根据detection p-value＜0.04为“present”,对照组三叉神经脊束核共检测到20025个,占总数的64.39%,而CSD实验组三叉神经脊束核共检测到20718个,占总数的66.62%。均在正常范围。在此基础上使用SAM分析,根据Score（d）、q-value（%）或者Fold Change作为标准挑选差异表达基因;筛选标准为:｜Score（d）｜≥2,同时FoldChange≥2或Fold Change≤0.5,包括了表达上调和下调的基因;据此相对于对照组,CSD实验组三叉神经脊束核转录子表达显著变化的有9个,其中下调2个（Change p-value＞0.997）,上调7个（Changep-value＜0.0025）。差异基因主要涉及细胞迁移、运动相关基因,并包括了泛素降解途径,生化酶类基因以及转录因子。可以看出细胞迁移、运动相关基因发生了明显的富集。3.与芯片结果相比,RT-PCR确证的四个基因Myh1、Myl1、Mylpf和Actal变化趋势相同,均是发生了上调。结论:1.高K+脑皮层微量注射可成功诱发CSD,建立有先兆偏头痛大鼠模型。2.通过芯片分析,得到有先兆偏头痛大鼠模型中差异基因。差异基因主要涉及细胞迁移、运动相关基因,并包括了泛素降解途径,生化酶类基因以及转录因子。可以看出细胞迁移、运动相关基因发生了明显的富集。3.对差异基因进行确证并开展功能分析。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 有先兆偏头痛大鼠模型的建立
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 有先兆偏头痛大鼠三叉神经脊束核基因表达谱分析
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 有先兆偏头痛大鼠三叉神经脊束核变化基因的功能分析
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 附录1:差异基因序列
• 在读期间发表文章及课题
• 致谢