水稻的几个Tos17转座子插入的抗病相关突变体的鉴定和基因功能分析

论文摘要

水稻是最主要的谷类作物,养活着世界一半以上的人口,所以有关它的抗病性,一直是研究的热点,同时水稻又是禾本科的模式作物,其全基因组测序已经完成,接下来重点研究的是它的基因功能。水稻的反转座子Tos17突变体就是一个研究基因的插入突变和功能分析的很有用的工具。因此,为了深入解析水稻的抗病分子机制,本研究引进一批可能的抗病相关基因的水稻Tos17插入突变体,经过繁殖后利用PCR技术进行了插入位点鉴定和纯合体筛选分析,从大量的突变体中挑选出等位基因双缺失的纯合突变体,且最终选定CLAT 3-15、NBS 6-2、RLK 7-10、bZIP1-13、bZIP1-16、bZIP19-1 纯合体突变株为进一步研究的对象,其中NBS编码的蛋白质含核苷酸结合域,RLK与编码受体激酶类蛋白相关,CLAT是与囊泡形成和运输相关的基因,bZIP是一个抗病等相关的转录因子,推测这些基因与水稻抗病性有关。设计引物,将CLAT、NBS、RLK、bZIP进行PCR扩增,利用Gateway技术克隆进入门载体pENTR-D-TOPO后,通过LR反应构建了与GFP融合的瞬时表达载体p-NBS-GFP、p-CLAT-GFP、p-RLK-GFP、p-bZIP-GFP,用基因枪轰击到洋葱表皮细胞,对各基因的进行亚细胞定位,结果显示CLAT、BS、RLK、bZIP主要定位在细胞膜上和细胞核中。为了进一步研究突变体的抗病性以及突变基因的功能,以野生型日本晴作为对照,在已挑选出的纯合突变体CLAT 3-15、NBS 6-2、RLK 7-10、bZIP1-13、bZIP1-16、bZIP19-1 中,用诱抗剂 BTH 处理水稻叶片,在不同时间下检测了植物防卫基因PBZ1和Act1在的动态表达。结果表明突变体RLK 7-10、bZIP1-13、bZIP1-16中的PBZ1均受到BTH的诱导表达,并且表达量随处理时间的延长而逐渐增强。而在在突变体CLAT 3-15、NBS 6-2和bZIP19-1中的PBZ1并不受到BTH的诱导。对突变体苗期进行了白叶枯菌的抗性鉴定,SPSS分析结果表明,纯合突变体 CLAT3-15、NBS 6-2、RLK7-10、bZIP1-13、bZIP1-16和bZIP19-1与野生型对白叶枯菌抗病性存在显著性差异。此外,还检测了防卫反应信号途径中涉及到的PAL酶和LOX酶的活性变化。在诱抗剂BTH不同时间的处理下,Tos17插入突变体中PAL酶参与抗病性反应。特别是在RLK7-10、bZIP19-1中,BTH诱导后会引起PAL酶活性的持续高水平。在突变体bZIP1-13、bZIP1-16和bZIP19-1中,BTH处理可能诱导增强了 LOX酶的活性,而在CLAT 3-15、NBS 6-2和RLK 7-10中,由于BTH的诱导可能推迟了 LOX酶的活性增加,从而推迟了抗病性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 水稻抗病基因的研究
• 前言
• 1.1 植物的抗病基因
• 1.2 水稻中的抗病相关基因
• 1.2.1 NBS（nucleotide binding site,核苷酸结合位点）类
• 1.2.2 RLK（receptor protein kinases,受体类蛋白激酶）类
• 1.2.3 CLAT（clathrin,网格蛋白）
• 1.2.4 bZIP转录因子
• 1.3 水稻反转座子突变体的研究
• 1.3.1 水稻反转座子的发现和分离
• 1.3.2 水稻反转座子Tos17的应用
• 1.3.3 Tos17反转座子存在的问题
• 1.4 本研究的选题
• 第二章 Tos17插入突变体鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 药品及试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种植Tos17插入突变体,繁殖种子
• 2.2.2 基因组DNA提取
• 2.2.3 第一轮PCR,鉴定有无Tos17插入
• 2.2.4 第二轮PCR,鉴定Tos17插入的纯合体
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 第一轮PCRTos17转座子鉴定结果
• 2.3.2 第二轮PCR鉴定纯合体结果
• 2.4 讨论
• 第三章 目标基因与GFP融合的瞬时表达载体构建及蛋白质细胞定位
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 药品及试剂
• 3.1.3 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 目标基因全长cDNA克隆
• 3.2.2 入门载体构建
• 3.2.3 GFP标记的目标基因瞬时表达载体的构建
• 3.2.4 重组质粒的鉴定与测序
• 3.2.5 瞬时表达和亚细胞定位
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组表达载体的鉴定
• 3.3.2 亚细胞定位结果
• 3.4 讨论
• 第四章 基因表达分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 药品及试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 诱抗剂BTH处理水稻突变体以及野生型
• 4.2.2 水稻总RNA的提取以及反转录反应
• 4.2.3 RT-PCR鉴定野生型中NBS、RLK、CLAT、bZIP基因的表达
• 4.2.4 RT-PCR鉴定防卫反应标记基因PBZ1的表达情况
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 野生型日本晴中NBS、RLK、CLAT、bZIP基因的表达结果
• 4.3.2 防卫反应标记基因PBZ1的表达结果
• 4.4 讨论
• 第五章 水稻突变体对白叶枯菌的抗性分析及防卫反应相关酶活性测定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料和菌株
• 5.1.2 药品及试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 水稻白叶枯菌培养
• 5.2.2 接种
• 5.2.3 水稻突变体对白叶枯菌的抗病性测定和评价
• 5.2.4 叶片中PAL酶活性测定
• 5.2.5 叶片中LOX酶活性测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 各突变体对白叶枯菌的抗病性
• 5.3.2 各突变体的叶片中PAL酶活性
• 5.3.3 各突变体叶片中LOX酶活性
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录