猪主要致病链球菌多重PCR诊断方法的建立及流行病学调查应用

论文摘要

链球菌种型众多,但致病性差异显著,本研究针对猪的主要致病种和型（C群马链球菌兽疫亚种Streptococcus equi subsp . zooepidemicus和猪链球菌1、2、7、9型Streptococcus suis,SS1、SS2、SS7、SS9）,在属、种、型三个水平上建立了一次性诊断链球菌的多重PCR诊断方法;并应用初步建立的多重PCR方法,结合本实验室在流行病学调查时使用的单纯PCR分型方法、血清学分型方法和MLST分型方法,对中国部分地区猪链球菌的流行病学进行调查分析。研究结果如下:（1）猪主要致病链球菌多重PCR诊断方法的建立:根据GenBank已登录序列,针对链球菌属保守基因（延伸因子EF-TU）、SS种保守基因（谷氨酸脱氢酶,GDH）、马链球菌兽疫亚种保守基因（类M蛋白,M-like）、SS型特异性基因（荚膜多糖,SS1型CPS1I、SS2型CPS2J、SS7型CPS7H和SS9型CPS9H）设计合成7对引物,预计扩增片段大小分别为:197、943、1137、441、291、541、388bp;制备混合模板（SS1、SS2、SS7、SS9和Streptococcus equi subsp . zooepidemicus）,建立多重PCR方法。设B群无乳链球菌、变形链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和水为对照进行特异性试验。用SS1、SS2、SS7、SS9标准株及Streptococcus equi subsp . zooepidemicus猪源555株进行准确性试验;并对16株链球菌临床分离鉴定菌进行验证性检测。梯度稀释混合模板进行敏感性试验。分别制备混合模板进行5次重复性试验。结果表明,建立的多重PCR方法在退火温度为61℃时可一次性扩出7条符合预期大小、序列正确的基因条带。特异性试验和准确性试验结果均符合预期,无非特异性、交叉反应、假阳性、假阴性条带出现,对16株临床分离鉴定链球菌的验证检测结果和细菌学鉴定及单纯PCR鉴定的符合率为100%。敏感性为0.08ng/μL;5次重复试验结果一致。结果提示,本研究建立的多重PCR方法,是截至目前唯一能够一次性在属、种、型三个水平上同时诊断猪主要致病链球菌的PCR诊断方法,具有高度特异性、准确性、敏感性和稳定性,高效、经济、快速是其优势,适用于猪场链球菌病监控和流行病学快速诊断。（2）流行病学调查:对2010年6个省份屠宰场的900份扁桃体或淋巴结样品进行细菌分离培养,然后用GDH、CPS1I、CPS2J、CPS7H、CPS9G基因序列PCR鉴定种型,并用血清凝集试验复检,共检出28株猪链球菌（检出率为3.11%）;其中3株为SS2,2株SS7,1株SS9,2株SS3,1株SS15,1株SS19,1株SS27,1株SS34;最后用多位点序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）系统研究各菌株之间的遗传关系,在13株能够定型的猪链球菌中,3株ST1,2株ST29,2株ST168,ST27、ST28、ST45、ST117、ST163和ST174各1株,两株申报ST新型;部分菌株的7个管家基因（aroA、Cpn60、Dpr、Gki、Muts、RecA、ThrA）中的某些基因的PCR扩增产物呈阴性或不能准确测序,导致无法从MLST数据库中比对出相应的ST型。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略语
• 第一篇 文献综述
• 第一章 猪链球菌病概述
• 1 病原学
• 2 流行病学
• 3 临床症状
• 4 病理变化
• 5 诊断
• 5.1 显微镜检查
• 5.2 分离培养
• 5.3 动物接种
• 5.4 分子生物学方法鉴定
• 6 防治
• 6.1 预防
• 6.2 药物治疗
• 7 小结
• 第二章 猪链球菌诊断分型鉴定技术的研究进展
• 1 传统分型方法
• 1.1 培养及形态学检查
• 1.2 生化试验鉴定
• 1.3 血清学试验
• 2 分子生物学方法
• 2.1 聚合酶链式反应
• 2.2 16S rRNA 基因对猪链球菌进行定型
• 2.3 利用分子伴侣（Cpn60）基因对猪链球菌进行基因分群
• 2.4 多位点序列分型技术
• 2.5 多位点酶电泳分型技术
• 2.6 限制性内切酶图谱分析分型技术
• 2.7 随机扩增DNA 片段多态性分析分型技术
• 2.8 脉冲凝胶电泳
• 2.9 核糖体分型技术
• 2.10 基因芯片技术检测猪链球菌
• 2.11 PCR-RFLP 方法
• 第二篇 试验部分
• 第一章 猪主要致病链球菌多重 PCR 诊断方法的建立
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株
• 1.2 细菌培养
• 1.3 模板制备
• 1.4 引物设计与合成
• 1.5 多重PCR 反应条件确定
• 1.6 特异性试验
• 1.7 准确性试验
• 1.8 敏感性试验
• 1.9 重复性试验
• 2 结果
• 2.1 多重PCR 反应条件确定
• 2.2 特异性试验
• 2.3 准确性试验
• 2.4 敏感性试验
• 2.5 重复性试验
• 3 讨论
• 第二章 2010 年中国部分地区猪链球菌的流行病学调查
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与抗血清
• 1.2 试剂、引物与培养基
• 1.3 样品采集
• 1.4 细菌分离培养
• 1.5 模板的制备
• 1.6 PCR 鉴定
• 1.6.1 引物
• 1.6.2 gdh PCR 反应体系及条件
• 1.6.3 1、2、7、9 型分型PCR 反应体系及条件
• 1.6.4 毒力因子PCR 反应体系及条件
• 1.6.5 MLST（多位点序列分型）PCR 反应体系及条件
• 2 结果
• 2.1 猪链球菌分布情况
• 2.2 PCR 鉴定结果
• 2.2.1 gdh 鉴定
• 2.2.2 1、2、7、9 型PCR 分型鉴定
• 2.2.3 多重PCR 分型鉴定
• 2.3 血清学检测
• 2.4 毒力因子PCR 检测结果
• 2.5 MLST 分型结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 作者简介
• 导师简介