论文摘要
1．目的肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，近年来，在我国肺癌的发病率和死亡率均有明显增长。肺鳞癌是肺癌中最为常见的类型，约占肺癌手术切除标本的60％以上。在肺鳞癌中，淋巴道转移是最常见且较为早期的扩散途径，也是肿瘤患者致死的重要原因。因此，揭示肺鳞癌淋巴转移的作用机制，对该病的治疗及预后具有重要的临床意义。肿瘤的发生发展是一个多基因多步骤的复杂过程，其中涉及到癌基因的激活和抑癌基因的失活。基因遗传不稳定性，如基因的微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）和杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）可能是引起抑癌基因失活，导致肿瘤发生发展的重要分子事件。nm23H1基因作为一种肿瘤转移抑制基因，类似于其他抑癌基因，它的失活可使其编码的蛋白NDPK（核苷酸二磷酸激酶）表达减少，进而促进肿瘤的发展、侵袭与转移。目前对中国人nm23H1基因遗传不稳定性如何参与肺鳞癌淋巴转移机制的研究，仍鲜见报道。本课题应用荧光PCR-单链构象多态性（FPCR-SSCP）方法、免疫组织化学染色法等方法，检测肺鳞癌nm23H1基因5’端非转录区微卫星位点的MSI和LOH以及nm23H1蛋白的表达，分析该基因位点遗传不稳定性对肺鳞癌蛋白表达及其进展的影响，以便为肺鳞癌临床治疗和预后提供实验依据。2．材料与方法2．1标本新鲜肺鳞癌手术标本50例，其中男性47例，女性3例。每例均包括肿瘤组织和周围正常组织。每例标本均作冰冻切片由病理医师予以确诊，并确保每例肿瘤标本中的肿瘤细胞比例在80％以上。2．2引物和抗体nm23H1基因5’端非转录区微卫星位点引物序列：5’ TAT GAG TTC AAC TAC GCACG 3’和5’ CTC GAG CAC AGG AGC AGG GTT 3’。鼠抗人nm23H1蛋白单克隆抗体。2．3基因组DNA的抽提按照试剂盒提供的方法，提取肿瘤组织基因组DNA。同时，抽提患者肿瘤周围正常组织基因组DNA作为对照。2．4荧光PCR-单链构象多态性方法（FPCR-SSCP）引物经荧光标记后，进行PCR扩增微卫星片断（110bp-120bp）。将PCR产物行毛细管电泳，同时采用Genescan分析软件给出电泳图谱。2．5免疫组织化学染色常规石蜡切片，脱蜡后行nm23H1蛋白免疫组织化学法染色，DAB显色，镜下控制显色时间，常规脱水、透明、中性树胶封片。同时，采用PBS代替一抗作阴性对照。2．6判断标准以正常组织的电泳图谱作为对照，如果在肿瘤组织电泳图谱上至少有一个对应峰发生移位或者峰的数量增多，则为微卫星不稳定（MSI）。已为MSI阳性的病例不再作LOH的评价。分别计算正常组织和肿瘤组织的两个主峰之间的峰值比率，然后由正常组织的峰值比率除以肿瘤组织的峰值比率，得到LOH指数（LOHindex）。如果LOH指数为≤0.67或≥1.5时则被认为是LOH。2．7图像分析每例标本连续选取不重叠的20个高倍视野，在相同灰度设定条件下测出GA（整个背景视野灰度值）、Ga（视野内nm23H1蛋白免疫组化阳性染色颗粒的灰度值）、AAa（nm23H1阳性细胞占视野面积的面积密度）。2．8数据处理用Excel函数算出PU值（positive unit阳性单位），代表nm23H1蛋白在肺鳞癌细胞的表达强度。2．9统计学分析所有数据均采用SPSS10.0软件包行单因素方差分析（One-Way ANOVA）、t检验和x2检验。3．结果3．1肺鳞癌与MSI、LOH的关系利用FPCR-SSCP检测法，发现50例肺鳞癌患者中能提供信息的个体数（杂合子数）为44例（88％），其可用于LOH分析。44例能提供信息的肺鳞癌患者中MSI和LOH检出率分别为11.36％（5／44）和25.00％（11／44），5例MSI全部发生在分化良好（G1为2例和G2为3例）及存活患者（1年生存率）中。然而，MSI和LOH的检出率与肺鳞癌分化程度、TNM分期、淋巴转移、患者生存状态及其它临床病理参数均无关（p＞0.05）。3．2肺鳞癌与nm23H1蛋白表达的关系nm23H1蛋白免疫染色反应阳性结果为棕黄色颗粒，主要位于细胞质，胞核和胞膜也有阳性反应结果。44例肺鳞癌nm23H1蛋白检出率为50％（22／44）。nm23H1蛋白阳性表达率在TNMⅠ期（65.22％）、无淋巴结转移组（66.67％）显著高于TNMⅢ期（18.18％）、淋巴结转移组（30.00％）（p＜0.05）。3．3 MSI、LOH与nm23H1蛋白表达的关系nm23H1蛋白在MSI阳性组和阴性组的阳性检出率分别为40％、51.28％，而其在LOH阳性组和阴性组的阳性检出率分别为54.55％、48.48％，但统计学分析表明MSI和LOH对nm23H1蛋白表达均无影响（p＞0.05）。另外，计算机图像定量分析显示，在各临床病理参数影响下，各组nm23H1蛋白的表达强度也没有差异（p＞0.05）。4．结论nm23H1蛋白可能对抑制肺鳞癌淋巴结转移有重要作用。nm23H1基因5’端非转录区微卫星的MSI和LOH对nm23H1蛋白的表达无影响，也未发现其与肺鳞癌发生发展具有相关性。
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