曼地亚红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离鉴定

论文摘要

本实验以曼地亚红豆杉为原材料，分离曼地亚红豆杉的内生真菌，通过镜检法和薄层层析法，鉴定出能够产生紫杉醇的曼地亚红豆杉内生真菌的种属。再通过紫外分光光度计测定内生真菌紫杉醇的产量，选出产量最高的菌种。筛选出产量最高的菌种后，通过优化培养基和培养条件、添加前体物质和诱导因子来提高紫杉醇的产量。通过上述实验，目的是为了能够建立起最佳的曼地亚红豆杉产紫杉醇的内生真菌的分离方法、鉴定方法和培养方法，为工业化生产紫杉醇提供一定的数据和技术支持。实验结果如下：1、从曼地亚红豆杉中分离得到了54株内生真菌，培养后采用镜检法和紫外分光光度法对其进行检测，通过观察菌种的菌落和菌丝的形态特征，然后采用TLC法检测菌种液体培养提取物，得到了6株能够产生紫杉醇的曼地亚红豆杉内生真菌，分别是黑孢属(Nigrospora sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、曲霉属(Aspergillums sp.)、头孢霉属(Cephalosporium sp.)、枝孢属(Cladosporium sp.)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)。2、采用紫外分光光度计法测得了6株内生真菌的紫杉醇的产量，分别为：黑孢属24.17μg/L、青霉属15.64μg/L、曲霉属20.73μg/L、头孢霉属29.45μg/L、枝孢属34.28μg/L、拟茎点霉属18.56μg/L。这6株内生真菌中，产量最高的是枝孢属。3、以枝孢属为培养菌种，通过优化枝孢属的发酵条件，提高了枝孢属发酵液中紫杉醇的产量。得到最佳的培养基成分为：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g（液体培养基不加琼脂粉），NH4NO37g/L，MgSO4·7H2O0.6g/L，自来水1000mL，pH7.0；最佳培养条件为：每个三角瓶的接种量为4%，装液量为200mL/500mL，摇床培养，培养温度为27℃，转速为180r/min，在培养的第8d添加前体物质苯丙氨酸8mg/L、诱导因子花生四烯酸0.4mg/L，培养天数为13d。利用优化后的条件对枝孢属进行培养，紫杉醇的产量为71.34μg/L，是原培养条件下紫杉醇产量的两倍还多。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 红豆杉概述
• 1.2 紫杉醇简介
• 1.2.1 紫杉醇的理化性质和功能
• 1.2.2 紫杉醇的抗癌作用机理
• 1.2.3 紫杉醇生产方法简介
• 1.3 植物内生真菌概述
• 1.3.1 植物内生真菌的起源和定义
• 1.3.2 植物内生真菌的普遍性和多样性
• 1.3.3 植物内生真菌的生物活性
• 1.3.4 植物内生真菌的生物学作用
• 1.3.5 目前植物内生真菌研究的主要内容
• 1.4 论文研究内容概述
• 1.4.1 研究内容
• 1.4.2 研究流程
• 1.4.3 研究创新点
• 1.4.4 研究意义
• 第二章 曼地亚红豆杉内生真菌的分离、纯化和保存
• 2.1 实验材料
• 2.2 内生真菌分离纯化培养基
• 2.3 实验仪器
• 2.4 菌种分离方法
• 2.5 菌种纯化方法
• 2.6 菌种保存方法
• 2.7 结果与讨论
• 2.7.1 曼地亚红豆杉内生真菌的分离结果
• 2.7.2 讨论
• 第三章 曼地亚红豆杉产紫杉醇内生真菌的鉴定
• 3.1 菌种活化
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 活化培养基
• 3.1.3 试剂和仪器
• 3.1.4 活化方法
• 3.2 菌种形态学观察
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 临时装片的制作
• 3.2.4 观察方法
• 3.3 菌种液体培养
• 3.3.1 材料
• 3.3.2 培养基的配制
• 3.3.3 试剂和仪器
• 3.3.4 培养方法
• 3.4 液体培养产物的提取
• 3.4.1 材料
• 3.4.2 试剂和仪器
• 3.4.3 提取方法
• 3.5 提取物的检测
• 3.5.1 材料
• 3.5.2 试剂和仪器
• 3.5.3 试剂配制
• 3.5.4 检测方法
• 3.6 结果
• 3.6.1 产紫杉醇内生真菌的形态学结果分析
• 3.6.2 产紫杉醇内生真菌的液体培养结果
• 3.6.3 产紫杉醇内生真菌的 TLC 检测结果
• 3.7 讨论
• 3.7.1 曼地亚红豆杉内生真菌培养讨论
• 3.7.2 目前产紫杉醇内生真菌的现状
• 3.7.3 薄层层析讨论
• 第四章 曼地亚红豆杉内生真菌紫杉醇产量的测定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 种子液的配制
• 4.2.2 菌种的液体培养
• 4.2.3 液体培养产物的提取
• 4.2.4 紫杉醇标准品紫外扫描
• 4.2.5 紫杉醇标准曲线的绘制
• 4.2.6 提取物的紫外检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 紫杉醇标准品紫外光谱扫描图
• 4.3.2 紫杉醇的标准曲线
• 4.3.3 菌种液体培养提取物的吸光度及紫杉醇产量
• 4.4 讨论
• 第五章 产紫杉醇曼地亚红豆杉内生真菌发酵条件的优化
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 培养基
• 5.2.2 液体培养
• 5.2.3 液体培养产物的提取
• 5.2.4 紫杉醇含量的测定
• 5.3 结果
• 5.3.1 最佳碳源的选择
• 5.3.2 最佳氮源的选择
• 5.3.3 最适硫酸镁浓度的选择
• 5.3.4 最适温度的选择
• 5.3.5 最适 pH 的选择
• 5.3.6 最适接种量的选择
• 5.3.7 最适装液量的选择
• 5.3.8 最适培养时间的选择
• 5.3.9 最适前体物质和诱导因子的选择
• 5.3.10 条件优化后菌种紫杉醇产量
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介