应用AdEasy腺病毒载体系统构建携带人骨形成蛋白2基因的重组腺病毒

论文摘要

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带hBMP2基因的重组腺病毒载体,应用于hBMP2基因治疗和在骨组织工程中对种子细胞进行基因改造,促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。 方法:常规CaCl2法制备E. coli DH5α感受态细菌,pcDNA3-hBMP2质粒转化E. coli DH5α感受态细菌。维特洁DNA小量纯化试剂盒抽提pcDNA3-hBMP2质粒,限制性内切酶XbaI、KpnI酶切,酶切产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,1.0%琼脂糖凝胶电泳结果与理论上pcDNA3-hBMP2质粒多克隆位点图谱吻合;将pcDNA3-hBMP2送交上海申友公司进行双向测序,hBMP2基因序列与已报告的hBMP2基因序列吻合。pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒转化E. coli DH5α感受态细菌,维特洁DNA小量纯化试剂盒抽提pAdTrack-CMV质粒,限制性内切酶XbaI、KpnI、PacI酶切,酶切产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,1.0%琼脂糖凝胶电泳结果与理论上pAdTrack-CMV质粒多克隆位点图谱吻合。pcDNA3-hBMP2质粒和腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV经KpnI和XbaI双酶切,凝胶回收试剂盒回收hBMP2基因片断和pAdtrack-CMV载体片断,回收的载体片断和目的基因片断T4 DNA Ligase进行酶连反应。酶连产物转化E. coli DH5α感受态细菌,维特洁DNA小量纯化试剂盒抽提重组pAdtrackCMV-hBMP2穿梭质粒,PmeI、PacI、BamHI酶切,酶切产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果与pAdTrackCMV-hBMP2质粒预期理论酶切位点相吻合,证明获得正确的重组pdTrackCMV-hBMP2质粒。参照Gene PulSeE XcellTM Instruction Manual（电转仪操作手册）制备E coli

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 pcDNA3-hBMP2扩增与鉴定
• 1.1 实验试剂与仪器设备
• 1.2 DH5α菌化学感受态制备及pcDNA3-hBMP2质粒转化
• 1.3 pcDNA3-hBMP2质粒DNA的提取及浓度测定
• 1.4 pcDNA3-hBMP2质粒XbaⅠ、KpnⅠ酶切鉴定
• 第二章 pAdtrack-CMV扩增与鉴定
• 2.1 pAdTrack-CMV质粒转化DH5α化学感受态菌
• 2.2 pAdTrack-CMV质粒DNA的提取及浓度测定
• 2.3 pAdTrack-CMV质粒XbaⅠ、KpnⅠ酶切鉴定
• 第三章 pAdTrack-hBMP2穿梭质粒的构建与鉴定
• 3.1 实验试剂与仪器设备
• 3.2 目的基因片段和载体片段凝胶回收
• 3.3 目的基因片段和载体片段连接反应
• 3.4 重组质粒pAdTrack-hBMP2筛选和酶切鉴定
• 第四章 pAdEasy-1扩增与AdEasey-1细菌的制备
• 4.1 实验试剂与仪器设备
• 4.2 AdEasey-1质粒电转化BJ5183电感受态菌
• 4.3 AdEasey-1质粒DNA的提取及浓度测定
• 4.4 AdEasey-1质粒酶切鉴定
• 第五章 pAdTrack-hBMP2与pAdEasy-1同源重组
• 5.1 实验试剂与仪器设备
• 5.2 同源重组及初步筛选重组子
• 5.3 pAd-hBMP2重组子酶切鉴定
• 5.4 pAd-hBMP2质粒电转化DH5α电感受态菌
• 第六章 pAd-hBMP2转染293E细胞
• 6.1 实验试剂与仪器设备
• 6.2 Pac1酶切线性化pAD-hBMP2质粒
• 6.3 293E细胞培养
• 6.4 pAd-hBMP2质粒转染293E细胞
• 参考文献
• 英文缩略语
• 综述
• 硕士期间论文发表情况
• 致谢
• 原创性声明
• 版权使用授权说明