论文摘要
药物代谢反应研究是药物研发中的一个重要课题,而新药研发早期,找到一个拥有良好药物代谢（DM）和药代动力学（PK）特性的化合物是其重要目标。药物在体内的代谢主要经历Ⅰ相和Ⅱ相反应,其中Ⅰ相反应对于药物小分子在体内的活性与毒性起着关键作用,而催化Ⅰ相反应的关键代谢酶系细胞色素P450混合功能氧化酶系（CYP450s）。阐明参与药物体内转化的CYP450酶,评价药物与代谢酶间的相互作用,对于理解药物代谢机制、预测药物相互作用和药物代谢多态性等方面具有重要意义。目前欧美各国也已经把CYP450s及其同工酶测定用于新药筛选及代谢研究,并把它列为新药申报必须进行的一项内容。盐酸双苯氟嗪是河北医科大学开发的新型哌嗪类钙通道拮抗剂,研究表明该药经由多种机制保护局灶性和全脑缺血再灌注损伤,其药理作用强于同类药氟桂利嗪和桂利嗪。本实验采用液质联用技术（LC-MS-MS）确定了盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中代谢生成的4个特征性代谢产物的结构,明确了其代谢途径；进行了肝微粒体温孵条件优化和酶动力学研究；利用化学抑制剂实验、相关性分析和重组酶实验研究了盐酸双苯氟嗪在不同性别大鼠肝微粒体中的代谢行为,鉴定了参与代谢产物生成的CYP450酶亚型,初步探讨了其酶催化机制；通过体内和体外实验考察了盐酸双苯氟嗪对不同性别大鼠CYP450酶活性的影响。上述系列研究为探讨盐酸双苯氟嗪的代谢途径和酶催化机制、研究盐酸双苯氟嗪与其他药物相互作用及作用机制奠定基础,从而为制定安全、合理的临床用药方案、减少药物不良反应提供了科学依据。第一部分盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中的代谢行为及其代谢物LC-MS-MS测定条件的确立目的：确定盐酸双苯氟嗪在不同性别大鼠肝微粒体中的代谢行为；建立盐酸双苯氟嗪及其代谢物的LC-MS-MS测定方法。方法：雌、雄SD大鼠各10只,体重230±20g,断头处死,取肝脏,超速离心法制备肝微粒体,Lowry法测定蛋白浓度,Omura和Sato方法测定CYP450酶含量；盐酸双苯氟嗪（100μM）在500μl肝微粒体温孵反应系统中（pH 7.4）于37℃水浴中振荡温孵30min,反应结束后于冰浴中终止反应。取100μl反应液,经乙酸乙酯萃取处理后,吸取上清液20μ1进行LC-MS-MS分析。肝微粒体样品分析测定采用Dikma RP-C18分析色谱柱（250×4.6mm,5μm）,流动相有机相A为甲醇/0.5%o甲酸（1000：0.5）,水相B为0.5‰甲酸溶液,采用梯度洗脱方式,洗脱程序为：0～1 min, 40～95% A; 1～6 min,95% A; 6～7 min,95～60% A;柱温40℃,流速为0.8ml/ml。盐酸双苯氟嗪及其代谢物采用ESI正离子模式检测。结果：雌、雄大鼠肝微粒体蛋白浓度分别为11.26±2.10 mg/ml和10.47±1.87 mg/ml, CYP450含量为0.627±0.10 nmol/mg protein和0.573±0.077 nmol/mg protein。盐酸双苯氟嗪在雄性大鼠肝微粒体中被迅速代谢成4个代谢物,它们分别是盐酸双苯氟嗪哌嗪环脱烷基代谢物（1-4-氟苯基）-4-哌嗪基丁酮（M1）、二苯亚甲基烷基氧化苯环还原代谢物4-羟基二苯甲酮（M2）、二苯亚甲基还原代谢物二苯甲醇（M4）和二苯亚甲基氧化代谢物二苯甲酮（M5）；在雌性大鼠肝微粒体中被迅速代谢成3个代谢物,分别是M1、M2和M5；以上结果提示,盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中的代谢行为具有性别差异。盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中的最初两步代谢反应是哌嗪环脱烷基生成M1和二苯亚甲基氧化生成M5,M5可以被进一步代谢为M2和M4；在两种不同性别大鼠肝微粒体中,M1的浓度均比其他代谢物为高,是盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中生成的最主要的代谢物。所建立的LC-MS-MS测定方法的回收率为78-86%,日内和日间RSD为0.15-14.42%,符合药代动力学分析方法的要求；盐酸双苯氟嗪在2.59-1295 ng/ml、M1在25.92-12961 ng/ml、M2在0.065-32.38 ng/ml、M4在2.63-1315 ng/ml、M5在2.46-1228 ng/ml范围内呈良好线性关系；盐酸双苯氟嗪及其代谢物短期稳定性、长期稳定性和3次冷冻-解冻循环稳定性符合相关要求。结论：本研究建立的LC-MS-MS测定方法符合药代动力学分析方法的要求,适合盐酸双苯氟嗪及其4个代谢物的含量测定,且盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中的代谢行为具有性别差异,M1为其最主要的代谢物。第二部分盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中温孵反应条件的优化和酶动力学研究目的：对盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体中温孵反应的条件进行优化,并测定盐酸双苯氟嗪代谢物的酶动力学参数,为后续大鼠肝微粒体实验提供依据。方法：以温孵时间、大鼠肝微粒体蛋白浓度和底物浓度为考察对象,固定其中两个温孵条件,观察第三个条件对盐酸双苯氟嗪代谢物生成量或生成速率的影响,进而优化温孵条件。用Lineweaver-Burk作图法计算盐酸双苯氟嗪在大鼠肝微粒体和CYP450重组酶中的酶动力学参数（最大速率Vmax、米氏常数Km和清除率Clint）。结果：盐酸双苯氟嗪在雌、雄大鼠肝微粒体中进行温孵反应的最佳时间分别为60min和30min,肝微粒体蛋白浓度均为1mg/ml,底物浓度分别为10gM和25gM。在雄性大鼠肝微粒体中,M1、M2、M4和M5的Km值分别是3.97μM、0.0064μM、4.14μM和3.69μM, Vmax分别是650.26、0.98、108.66和100.92 pmol/min/nmol P450;在雌性大鼠肝微粒体中,M1、M2和M5的Km值分别是3.89μM、0.0055μM和5.63μM,Vmax分别是330.17、0.58和6.54 pmol/min/nmol P450。在重组酶CYP3A1温孵液中,M1、M2、M4和M5的Km值分别是3.52μM、0.0067μM、5.67μM和3.90μM, Vmax分别是683.15、1.14、136.40和115.41 pmol/min/nmol P450;在重组酶CYP3A2温孵液中,M1、M2、M4和M5的Km值分别是3.49μM、0.0081μM、5.03μM和3.95μM, Vmax分别是719.44、1.57、144.91和132.80 pmol/min/nmol P45。结论：盐酸双苯氟嗪在雌性或雄性大鼠肝微粒体的最佳温孵时间分别是60min和30min,最佳肝微粒体蛋白浓度均为1mg/mL;最佳盐酸双苯氟嗪浓度为10μM或25μM。在此优化的温孵条件下,代谢物生成速率均能达到饱和状态,所测定的大鼠肝微粒体和CYP450重组酶的各项酶动力学参数（Vmax、Km和Clint）准确、可靠,可满足盐酸双苯氟嗪体外代谢研究要求,为后续大鼠肝微粒体和CYP450重组酶实验提供依据。第三部分参与盐酸双苯氟嗪代谢的大鼠肝微粒体CYP450酶的鉴别目的：研究不同性别大鼠肝微粒体中,参与盐酸双苯氟嗪代谢的CYP450酶亚型。方法：运用CYP450酶选择性抑制剂、相关性分析和重组酶实验探讨参与盐酸双苯氟嗪代谢的CYP450酶亚型。化学抑制剂实验,选用P450酶特异性抑制剂[]呋拉茶碱（CYP1A2, 1-100μM）、毛果芸香碱（CYP2A1,0.5-100μM）、邻甲苯海拉明（CYP2B1, 1-100μM）、磺胺苯毗唑（CYP2C6,1-200μM）、西咪替丁（CYP2C11和CYP2C12,0.5-100μM）、奎尼丁（CYP2D1, 1-100μM）、二乙基二硫代氨基甲酸酯钠（CYP2E1,2.5-200μM）和酮康唑（CYP3A,0.5-200μM）分别加入不同性别大鼠肝微粒体中与盐酸双苯氟嗪共同温孵,测定反应系统中代谢产物生成量；用含抑制剂的样品溶液中代谢物的生成量与不含抑制剂的阴性对照溶液中代谢物生成量的百分比定量,评价不同抑制剂对各代谢物生成的影响。相关性分析实验,将盐酸双苯氟嗪分别与15个来自不同大鼠的肝微粒体样本共同温孵,测定盐酸双苯氟嗪代谢反应与P450酶活性的相关性。以下列酶亚型特异性探针药物的代谢反应生成速率来测定P450酶的活性：非那西丁O-脱乙基反应（CYP1A2）、睾酮7a-羟基化反应（CYP2A1）、睾酮16p-羟基化反应（CYP2B1）、双氯芬酸4-羟基化反应（CYP2C6）、睾酮16α-羟基化反应（CYP2C11） 5α-androstane-3α,17β-diol-3,17-disulphate 15β-羟基化反应（CYP2C12）、右美沙芬O-脱甲基反应（CYP2D1）、氯唑沙宗6-羟基化反应（CYP2E1）和咪达唑仑1’-羟基化反应（CYP3A）。将盐酸双苯氟嗪代谢物的生成速率与探针药物代谢物的生成速率进行线性回归,计算相关系数。CYP450重组酶实验,盐酸双苯氟嗪与重组酶（CYP1A2, CYP2A1, CYP2B1, CYP2C6, CYP2C11/12, CYP2D1, CYP2E1和CYP3A1/2）进行温孵,测定盐酸双苯氟嗪代谢物的生成速率,确证参与盐酸双苯氟嗪代谢的CYP450酶亚型。结果：抑制剂研究、相关性分析和重组酶实验三种分析方法测定结果均显示,雄性大鼠肝微粒体中,代谢盐酸双苯氟嗪生成M1的最主要的酶亚型是CYP2A1,其他依次为CYP3A、CYP1A2和CYP2E1,而CYP2C11的作用最小。代谢盐酸双苯氟嗪生成M2的CYP450酶按作用大小依次为CYP3A、CYP2A1、CYP1A2、CYP2C11和CYP2E1。转化盐酸双苯氟嗪生成M4的酶亚型活性高低依次为CYP3A、CYP2A1、CYP2E1和CYP2C11,而参与M5生成的酶亚型分别为CYP3A、CYP2A1和CYP2C6。其中CYP3A和CYP2A1均参与了雄性大鼠肝微粒体中4种代谢物的生成反应。在雌性大鼠肝微粒体中,CYP1A2和CYP3A参与了M1的生成,且CYP3A的作用比CYP1A2稍强。参与M2生成的5种P450酶按作用大小依次为CYP3A、CYP1A2、CYP2C6、CYP2A1和CYP2E1。而CYP3A、CYP2A1、CYP2D1和CYP1A2则是参与M5生成的4种酶亚型。其中,CYP3A和CYP1A2均参与了雌性大鼠肝微粒体中3种代谢物的生成反应。由此可见,CYP3A是盐酸双苯氟嗪在不同性别大鼠肝微粒体中代谢的最主要的酶亚型,重组酶实验结果表明,CYP3A2显示出比CYP3A1更强的活性。结论：三种方法分析结果共同确证了CYP3A是两种不同性别大鼠肝微粒体中参与盐酸双苯氟嗪代谢的最主要CYP450酶亚型,其中CYP3A2的活性比CYP3A1更强；均能参与盐酸双苯氟嗪代谢物生成反应的CYP450酶亚型,在雌性大鼠为CYP1A2,在雄性大鼠为CYP2A1,具有明显的性别差异。第四部分盐酸双苯氟嗪对大鼠CYP450酶活性的影响目的：通过大鼠体内、外实验,观察盐酸双苯氟嗪对不同性别大鼠CYP450酶的影响。方法：在正常雌、雄大鼠肝微粒体温孵反应系统中加入不同浓度盐酸双苯氟嗪（0-200μM）和探针药物共同温孵,反应结束后,样品经处理,进行LC-MS-MS分析,测定探针药物代谢产物生成量；用加入盐酸双苯氟嗪的样品溶液中探针药物代谢物的生成量与不加盐酸双苯氟嗪的阴性对照溶液中代谢物生成量的百分比定量,观察盐酸双苯氟嗪对CYP450的影响。SD大鼠,雌、雄各半,随机分为空白组、盐酸双苯氟嗪低、中、高剂量组和苯巴比妥组,每组6只。实验组分别灌胃给予盐酸双苯氟嗪30、60、90 mg/kg,苯巴比妥组灌胃给予苯巴比妥120 mg/kg,空白对照组灌胃给予等容积0.5%羧甲基纤维素钠,连续给药14天。第15天分别灌胃给予Cocktail探针药物非那西丁、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗和氨苯砜,于灌胃后5、15、40、60、90、120、180、240、360、480、720min时,眼内眦取血,置肝素锂抗凝管中,离心,分离出血浆,经乙酸乙酯萃取后,进样20μL进行LC-MS-MS分析,绘制药-时曲线,计算药代动力学参数；测定给药360min时血浆样品中探针药物及其代谢物的浓度。取血结束后,断头处死大鼠,取肝脏,称重,制备肝微粒体。在肝微粒体温孵反应系统中加入探针药物,反应结束后,样品经处理,进行LC-MS-MS分析,测定探针药物及其代谢物的浓度,计算给药360min时血浆样品和肝微粒体温孵系统中探针药物的代谢率。通过比较实验组和空白对照组的相对肝脏重量、蛋白浓度、CYP450酶含量、药-时曲线、药代动力学参数和探针药物的代谢率,确定盐酸双苯氟嗪对CYP450酶活性的影响。结果：在正常雄性大鼠肝微粒体温孵液中,盐酸双苯氟嗪对CYP2C6、CYP2D1和CYP2C11有抑制作用,其IC50值分别是8.85、20.93和69.45μg/mL;在正常雌性大鼠肝微粒体温孵液中,盐酸双苯氟嗪对CYP2C12、CYP2C6、CYP2D1和CYP3A显示抑制作用,其IC5o值分别是19.3、35.01、36.69和138.53μg/ML。雌、雄大鼠被不同剂量盐酸双苯氟嗪诱导14天后,低、中、高剂量盐酸双苯氟嗪对雌、雄大鼠相对肝脏重量、蛋白浓度和CYP450酶含量没有影响；苯巴比妥使雌、雄大鼠相对肝脏重量、蛋白浓度和CYP450酶含量均显著增加。药动学参数和探针药物实验结果均显示,在雌性大鼠,盐酸双苯氟嗪低剂量仅对CYP2D1有抑制作用,中高剂量则不仅抑制CYP2D1,尚能抑制CYP2C12和CYP3A,与雌性大鼠肝微粒体温孵结果基本一致,所不同的是在体外试验盐酸双苯氟嗪抑制CYP2C6,而在整体试验其三个剂量均对CYP2C6有诱导作用。在雄性大鼠,盐酸双苯氟嗪低剂量仅对CYP2C11有诱导作用,并不抑制任何CYP450酶；中剂量则可抑制CYP2D1和诱导CYP2C11及CYP3A;高剂量既可抑制CYP2C6和CYP2D1,又能诱导CYP2C11和CYP3A,而在雄性大鼠肝微粒体温孵试验盐酸双苯氟嗪则对这4个CYP450酶均呈抑制作用。苯巴比妥对雌雄大鼠的CYP1A2、CYP2C11（雄性大鼠特异性）、CYP2C12（雌性大鼠特异性）、CYP2D1、CYP3A均有诱导作用。结论：大鼠肝微粒体体外温孵研究结果表明,盐酸双苯氟嗪对CYP450酶活性均呈抑制作用,但存在明显的性别差异。而在整体动物试验研究,盐酸双苯氟嗪对某些CYP450酶活性的抑制作用与体外研究结果基本一致,但对另外一些CYP450酶活性有诱导作用,也存在明显的性别差异。临床用药应避免将盐酸双苯氟嗪与经这些酶代谢的药物共同应用,以减少药物相互作用和不良反应的发生。