论文摘要
CD34是分子量约为110kDa的穿膜糖蛋白,是目前所知的最早期、最广泛表达于人类HSC上的膜抗原。在临床造血干细胞移植中,CD34单抗已被广泛用于纯化造血干细胞。但现有的抗人CD34单克隆抗体均为鼠源,进入人体后可能诱发人抗鼠抗体免疫应答（HAMA）。因此,为了提高造血干细胞移植的安全性,我们拟制备新型的抗CD34人源化抗体,以降低其免疫原性,提高其在临床使用中的安全性。我们首先采用传统的杂交瘤技术制备了三株抗人CD34单克隆抗体（5812、4C8和2E10）,利用试剂盒检测其亚型分别为（IgG2a,κ）、（IgG1,κ）和（IgG3,κ）;流式细胞术的结果表明,与商品化的CD34单抗581对照一样,该三株抗体都能与表达CD34抗原的KG-1a细胞特异性结合;Western blotting分析进一步证实它们特异性识别CD34分子;表位鉴定结果表明5B12、4C8和2E10分别识别CD34分子的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类表位。我们采用5’RACE技术获得了5812、4C8和2E10的可变区全长cDNA,将可变区基因序列输入计算机在GenBank数据库中检索,证明是新克隆的抗体基因。在获得5812、4C8和2E10这三株单抗的可变区基因之后,我们将它们分别与人源抗体的恒定区连接,然后将嵌合抗体轻、重链基因分别克隆到真核表达载体,最后将嵌合抗体轻、重链表达载体共转染CHO-K1细胞,经选择培养基筛选后获得稳定表达抗体蛋白的CHO细胞克隆。获得的CHO细胞培养上清经Protein A亲和分离纯化,获得纯度在90%以上的CD34嵌合抗体c5812、c4C8、c2E10;抗原结合活性结果表明该三株嵌合抗体都能很好地与KG-1a细胞结合;竞争抑制实验结果表明它们都能与各自对应的鼠源抗体竞争,而且它们的IC50值相似,说明三株嵌合抗体都保留了与各自对应的鼠源抗体相似的亲和力和特异性。为了进一步减小嵌合抗体的免疫原性,我们利用计算机辅助设计对Ⅱ类CD34单抗4C8进行人源化改造。在确定了4C8可变区中CDR区和FR区的范围之后,我们将CDR区直接移植到人源抗体模板的FR中,构建CDR移植抗体,并将获得的人源化轻、重链抗体基因克隆到表达载体共转染COS细胞,用流式细胞术测定其抗原结合活性,结果发现这个人源化抗体的亲和力基本完全丧失。为了重建人源化抗体的亲和力,我们利用计算机辅助设计对可能影响抗体亲和力的FR区重要残基进行回复突变分析,分别构建了5条不同的人源化重链和5条不同的人源化轻链,经过活性筛选,我们发现对于人源化重链来说,框架区残基2,46,68,69,82,91的回复突变是必要的,将它们全部突变为鼠源残基后得到了一个活性超过嵌合抗体重链的人源化重链4C8VHb。我们采用同样的方法对人源化轻链基因进行改造,发现将轻链框架区残基3,4,46全部回复突变获得的人源化轻链4C8VLb与4C8VHb组成的人源化抗体h4C8的抗原结合活性超过了嵌合抗体c4C8,在筛选得到高亲和力的人源化抗体h4C8之后,我们又建立了高效表达h4C8的CHO-K1细胞株,为今后的实验和临床研究打下了基础。竞争抑制实验结果表明人源化抗体可竞争抑制原鼠源抗体与CD34阳性细胞的结合并具有与鼠源抗体相似的亲和力,表明h4C8是一个改造成功的人源化抗体综上所述,本课题中构建的抗CD34人源化抗体可能取代现有的鼠源CD34单抗用于临床上造血干细胞的分选,从而提高临床造血干细胞移植的安全性。