论文摘要
细胞核酸结合蛋白（cellular nucleic acid-binding protein,CNBP）是一个含有7个锌指结构（Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys,CCHC）的19kD蛋白,又称为锌指蛋白9（zincfinger protein 9,ZNF9）。人CNBP有α与β两种主要转录本,分别编码177个和170个氨基酸。CNBP广泛存在于真核生物中,在进化过程中具有高度的保守性,脊椎动物CNBP的氨基酸序列同源性高达80%以上,提示它可能行使基础而重要的生物学功能。CNBP可以结合DNA和RNA,具有在转录水平和翻译水平对基因表达进行双重调节的能力。CNBP在各组织器官广泛表达,在脊椎动物胚胎发育中扮演重要角色。目前CNBP具体的生物学功能和作用途径还不清楚。我们克隆了人CNBP全长cDNA,发现了3种新的转录本,包括CNBPβ变体1（编码171个氨基酸）,CNBPβ变体2（编码172个氨基酸）,CNBPα变体1（编码178个氨基酸）。我们成功构建了原核表达载体pET-30a（+）-CNBPβ,表达纯化了CNBPβ融合蛋白,免疫新西兰大白兔,获得了效价高、特异性好的兔抗CNBP多克隆抗体。为了阐释CNBP在基因表达调控中的作用,我们利用双萤光素酶报告基因系统检测了CNBP的转录调节能力,发现CNBPα与CNBPβ都具有转录激活能力。通过对CNBPβ氨基端与羧基端的缺失突变分析发现CNBPβ的转录激活能力依赖于蛋白质C端区域,特别是C端含有第7锌指的145～170位氨基酸区域,其中Thr165位潜在磷酸化位点是CNBP实现转录激活的重要活性位点。为了探寻CNBP的生物学功能,我们利用RNAi技术建立了CNBP基因沉默的HeLa细胞系,发现CNBP表达量下调后细胞生长变慢,S期细胞减少,G1期细胞增多,集落形成实验显示HeLa细胞在CNBP表达量下调后增殖能力下降,恶性程度降低。我们又建立了稳定过表达CNBP的HeLa细胞系,发现CNBP表达量上调后出现相反的变化。这表明CNBP具有促进细胞增殖的能力。为了进一步揭示CNBP在体内发挥生物学功能的分子机制,我们首先利用酵母双杂交技术以人CNBPβ为诱饵筛查了人胎脑文库,但未能筛选到与CNBP相互作用的蛋白质。我们又利用基因芯片技术对CNBP基因沉默前后HeLa细胞中基因转录情况的差异进行了检测,发现了583个差异表达的基因,对差异基因进行功能分类分析发现变化的基因主要集中在发育与翻译调节两个方面。我们初步筛选了15个可能受CNBP调控的候选基因,对其中CPS1、BMP2、ALPI、SARS等4个候选基因进行了验证,初步证明了他们受CNBP的正调控;并利用双萤光素酶报告基因系统初步证明了ALPI基因启动子区可能存在对CNBP表达量变化产生应答的顺式作用元件。在本研究中我们发现了CNBP 3个新的转录本,利用报告基因系统证明CNBP具有转录激活能力,首次报道CNBP转录激活结构域位于蛋白质的C端,并发现了重要活性位点。我们还证明CNBP可以通过推动细胞周期的进程来促进细胞增殖。受CNBP调控候选基因的发现也为今后研究其作用途径提供了重要线索。
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相关论文文献
- [1].草鱼CNBP的分子特征及其进化分析[J]. 动物学杂志 2008(06)