SpiC/SsaM蛋白复合物和IpaB/Mad2B蛋白复合物的表达、纯化与结晶

论文摘要

第一部分编码于沙门氏菌（Salmonella）毒力岛2的SpiC蛋白在沙门氏菌得以存活于宿主吞噬性细胞内起到必要性的作用。沙门氏菌侵入宿主细胞后并不滞留于胞质中,而是形成一个沙门氏菌内含小泡（SCV）,并通过三型分泌系统分泌大量的效应蛋白改变宿主生物学行为。沙门氏菌在吞噬性细胞内得以存活并复制是靠其自身的避免SCV与溶酶体融合这一机制,而SpiC在这一机制中的功用是不可或缺的。虽然使用基因序列比对和蛋白质一级序列比对无法得到任何有关SpiC功能作用的信息,但是SpiC与同位于一个操纵子下的SsaM之间的显著并且特异的结合,暗示了一个围绕着SpiC和SsaM的蛋白质复合物作用于转运元的形成进而控制其它效应蛋白的分泌顺序。为了从蛋白质结构层面上研究SpiC的生物学功能,我们共纯化了SpiC和SsaM。因为在E.coli表达体系中单独表达SsaM并不可以得到可溶性的蛋白,所以采取了将携带有His标签的SpiC和不携带任何标签的SsaM共同转化入感受态细胞并协同表达的手段。SsaM因为与SpiC的结合变得可溶,蛋白质复合物利用亲和层析技术得以纯化。在胰蛋白酶限制性酶切实验中发现SpiC与SsaM的复合物较SpiC单独存在于溶液中时稳定很多。之后便利用离子交换层析和凝胶过滤层析手段大量纯化了胰蛋白酶限制性酶切后的SpiC、SsaM复合物,并进行了结晶实验。第二部分福氏志贺氏菌（Shigella flexneri）通过三型分泌系统分泌自身编码的效应蛋白IpaB,该蛋白在福氏志贺氏菌入侵宿主细胞、宿主细胞内定殖以及对抗宿主细胞固有免疫机制方面都起到关键作用。IpaB被分泌到胞质中后,特异性的与宿主胞内Mad2B蛋白结合。Mad2B负责与参与细胞周期调控的E3泛素化连接酶APC（Anaphase-promoting Complex）竞争性的结合底物特异性激活因子Cdc20和Cdh1。Cdc20和Cdh1是APC活性状态中不可或缺的,Mad2B与二者的结合抑制了APC的激活过程。而IpaB与Mad2B的结合释放了Cdc20和Cdh1,从而持续性的激活了APC。APC活性时间表的扰乱使得宿主细胞周期停滞在有丝分裂期。小肠原始上皮细胞分生的抑制,使得小肠上皮细胞快速更新机制受到影响,可以说由IpaB引起的小肠上皮细胞自我更新机制失调,对于福氏志贺氏菌能够得以逃避被宿主免疫机制清除来说尤为重要。为了从蛋白质结构学层面上研究IpaB与Mad2B相互作用的机制,其中牵涉到的构象的变化,以及IpaB如何与Cdc20和Cdh1竞争Mad2B,我们共纯化了IpaB片段1-246和Mad2B,同时进行了初步结晶实验,并得到了晶体。

论文目录

• Abstract
• 摘要
• 第一章 研究概述
• 第一节 课题背景介绍
• 1.SpiC及其相关背景介绍
• 1.1 沙门氏菌简介
• 1.2 SpiC功能背景简介
• 1.3 SsaM与SpiC之间联系
• 2.IpaB和Mad2B相关背景知识
• 2.1 福氏志贺氏菌简介
• 2.2 IpaB及Mad2B相关背景介绍
• 第二节 蛋白质结构学研究方法介绍
• 1.研究方法总述
• 2.研究手段详细介绍
• 2.1 原核细胞表达体系
• 2.2 pET表达系统
• 2.3 蛋白纯化
• 2.3.1 亲和柱纯化
• 2.3.2 快速液相色谱纯化
• 2.4 蛋白晶体学介绍
• 第二章 实验设计与实验结果
• 第一节 实验设计与方法
• 1.实验步骤
• 2.实验材料、试剂、仪器
• 2.1 实验所需原始材料
• 2.1.1 分子克隆、质粒构建所需材料和试剂
• 2.1.2 蛋白表达、纯化所需材料和试剂
• 2.1.3 蛋白结晶所需材料和试剂
• 2.2 实验所需溶液与试剂配方和参数
• 2.3 主要仪器
• 3.实验方法
• 3.1 基因克隆
• 3.2 原核宿主表达与检测
• 3.3 大量表达和纯化
• 3.4 悬滴法生长晶体的一般方法
• 3.5 目的蛋白限制性酶切分析
• 第二节 实验结果及分析
• 1.SpiC与SsaM及二者复合物的表达与纯化结果
• 1) SpiC蛋白表达与纯化
• 2) 全长SpiC的限制性蛋白酶酶切实验
• 3) SpiC携带其他纯化标签,以及片断表达情况考察
• 4) SsaM蛋白表达与纯化
• 5) SpiC与SsaM的共转化和表达
• 6) SpiC与SsaM的其他片断共转化表达情况
• 7) SpiC与SsaM共表达产物Trypsin酶切实验
• 8) SpiC与SsaM复合物结晶实验
• 2.Mad2B和IpaB的纯化与二者相互作用的研究
• 1) Mad2B蛋白表达与纯化
• 2) IpaB蛋白表达与纯化
• 3) Mad2B与IpaB片段共纯化实验
• 4) Mad2B与IpaB片断1-246混合结晶实验
• 参考文献
• 致谢