论文摘要
疟疾是一类严重危害人类健康的热带传染性疾病，在全球有着很高的发病率和致死率，而红内期疫苗是疟疾防治中最经济有效的方式之一。虽然全世界科学家付出了极大的努力，但到目前为止，仍然没有一种有效的红内期亚单位疫苗问世。目前红内期亚单位疫苗存在的主要问题在于疟原虫抗原的高变异性及裂殖子表面蛋白的多态性。最近，红内期全虫疫苗被证实它能够保护宿主抵抗多种疟原虫攻击，而且其保护作用主要由CD4+T细胞所介导，这也许能为红内期亚单位疫苗的设计提供一种新的策略。然而，红内期全虫疫苗中疟原虫特异性CD4+T细胞活化的具体机制仍然很不清楚。补体作为天然免疫系统十分重要的组成部分，最近的研究表明，补体在适应性免疫的调节中同样发挥着不可替代的作用。比如，补体C5a通过调节DC功能间接影响CD8+T细胞活化。然而，C5a在全虫疫苗诱导CD4+T细胞反应中的作用还不清楚。在本研究中，我们首先观察红内期全虫疫苗免疫后，WT和C5aR-/-小鼠体内补体活化及C5a产生情况，并确认C5a/C5aR信号是否在红内期全虫疫苗中发挥作用。然后我们检测两种小鼠免疫后体内抗体及CD4+T细胞功能是否发生改变，并采用过继转移实验证实是抗体还是CD4+T细胞参与免疫保护过程。最后，我们检测两种免疫小鼠脾脏Treg频率及DC功能，找到影响C5aR-/-免疫小鼠CD4+T细胞功能下降的主要原因。一、C5aR缺失显著降低全虫疫苗诱导小鼠的保护性免疫力1．观察全虫疫苗免疫后，WT小鼠和C5aR-/-小鼠体内补体活化及C5a产生情况：与未免疫的正常小鼠相比，两种免疫小鼠血清C5a含量均升高。在免疫后第二天，其浓度达到最高峰，且两种小鼠血清C5a浓度变化趋势基本一致。2．C5aR-/-降低小鼠红内期全虫疫苗的保护性：末次免疫后两周，用p.y l7XL pRBC攻击免疫小鼠，观察小鼠的原虫血症及存活率，发现与正常小鼠相比，两种免疫小鼠均具有免疫保护作用。但是，C5aR-/-免疫小鼠免疫保护效果明显低于WT免疫小鼠。这说明红内期全虫免疫能够提供免疫保护作用，而C5a/C5aR信号在其中发挥着重要的作用。二、C5aR缺失影响DC活化CD4+T细胞功能，从而降低全虫疫苗诱导小鼠保护力1．抗体不能为红内期全虫疫苗提供保护：分离末次免疫后两周小鼠的血清，进行疟原虫特异性抗体检测，发现两种小鼠血清IgG与IgG2a滴度相同。虽然WT免疫小鼠IgG1滴度比C5aR-/-免疫小鼠高一个数量级，但两者之间没有统计学差异。将两种小鼠的血清过继转移至正常未免疫小鼠，发现并不能保护小鼠抵抗疟原虫的攻击，说明抗体不能为红内期全虫疫苗提供保护。2．C5aR-/-小鼠CD4+T细胞的功能及记忆性T细胞的形成受到明显抑制：分离末次免疫后两周小鼠脾脏淋巴细胞，观察疟原虫特异性CD4+T细胞增殖、IFN-γ分泌及记忆性T细胞的形成情况，发现免疫后敲除小鼠的脾脏疟原虫特异性CD4+T细胞增殖及IFN-γ分泌能力均弱于WT小鼠，且记忆性CD4+T细胞的形成受到明显抑制。3．CD4+T细胞功能及记忆性T细胞形成缺陷是C5aR缺失小鼠保护力下降的重要原因：分离末次免疫后两周脾脏CD4+T细胞，将其过继转移至正常未免疫小鼠。在用P.y l7XL pRBC攻击后发现，免疫后的WT小鼠脾脏CD4+T细胞能够提供完全性保护作用，而敲除小鼠过继转移组小鼠最后全部死亡，说明红内期全虫疫苗的保护效果主要是由CD4+T细胞提供，而且C5aR-/-小鼠保护力下降的重要原因在于CD4+T细胞功能及记忆性T细胞形成缺陷。4．Treg可能不影响C5aR-/-免疫小鼠CD4+T细胞的功能：分离末次免疫后两周小鼠脾脏淋巴细胞，检测Treg频率的变化，发现C5aR-/-免疫小鼠脾脏淋巴细胞Treg频率略高于WT免疫小鼠，但两者之间没有统计学差异，说明Treg可能不影响C5aR缺失免疫小鼠CD4+T细胞的功能。5．C5aR缺失免疫小鼠脾脏DC功能显著下降：分离初次免疫后2、4、6天小鼠脾脏DC，检测其表面共刺激分子表达及刺激活化T细胞能力，发现敲除小鼠DC共刺激分子CD86、MHC-Ⅱ分子表达水平以及刺激活化T细胞能力均显著低于WT免疫小鼠，这说明C5aR缺失能够影响红内期全虫疫苗诱导小鼠DC的成熟，进而影响CD4+T细胞的功能。6．C5a和P.y17XL裂解产物单独或联合刺激均不能直接诱导DC的成熟：将BMDC与C5a、P.y17XL、C5a+P.y17XL分别进行共培养，发现C5a和P.y17XL单独或联合刺激均不能诱导DC表面共刺激分子CD86、CD40、MHC-Ⅱ分子上调，提示C5a/C5aR信号可能不是通过直接作用的方式影响全虫疫苗诱导DC成熟。本研究成功建立了红内期全虫疫苗模型，利用该模型我们发现C5a/C5aR信号通过影响疟原虫特异性CD4+T细胞功能，从而在红内期全虫疫苗中发挥重要作用，而这一作用与DC功能的改变密切相关。本研究首次证实了C5a/C5aR信号是红内期全虫疫苗有效诱导小鼠产生保护性免疫所必需的，一定程度上揭示了红内期全虫疫苗疟原虫特异性CD4+T细胞活化和调节机制，这可为从补体活化角度设计有效的亚单位疟疾疫苗提供新思路。
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- [2].C5a/C5aR信号在约氏疟原虫肝期发育及遗传减毒子孢子诱导小鼠保护性免疫中的作用[J]. 免疫学杂志 2015(03)
- [3].C5a/C5aR通路对约氏疟原虫增殖和小鼠生存的影响[J]. 热带医学杂志 2011(02)
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