拟黑多刺蚁hsp90基因的克隆与mRNA水平表达及其对发育影响的研究

论文摘要

热激蛋白（Heat Stress Proteins, HSPs）又称热休克蛋白（Heat Shock Protein, HSPs）,是机体受到外界的一些环境条件刺激如：氧气缺乏、温度过高或过低、缺乏食物、受到伤害、环境污染等而产生的一类蛋白质,该类蛋白质可使生物体受到的损伤降到最小程度。HSP90是热激蛋白中分布最广泛的一类蛋白,对多种蛋白的空间结构起着调控作用。拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger）营群居生活,是昆虫纲、多刺蚁属的一种,因为其特殊的生活环境,有着特殊的药用价值。拟黑多刺蚁群体存在严格的品级分化,其行为复杂,是进行昆虫个体发育及其分化方面研究的良好材料。本实验选取拟黑多刺蚁为材料,结合RT-PCR技术和RACE技术,扩增了hsp90基因cDNA全长序列,并运用生物信息学方法分析其基因序列和编码的蛋白质序列,运用荧光实时定量技术研究其基因在拟黑多刺蚁不同品级和不同发育阶段虫体中mRNA水平的表达情况。主要实验结果如下：1.获得的拟黑多刺蚁hsp90基因的cDNA序列全长为2325bp,其开放阅读框长为2133bp,编码711个氨基酸,5’非编码区长度为129bp,3’非编码区长度为63bp。将其命名为Pvhsp90,上传至美国国立生物技术信息中心（NCBI）GenBank数据库,获得的序列号为JN100104.1。2.生物信息学分析Pvhsp90的氨基酸序列和蛋白质序列。同源性分析表明Pvhsp90编码的蛋白序列与数据库中其它生物的HSP蛋白相似性很高,均在95%以上。系统进化分析表明该蛋白保守性较高,属于ATP酶超家族。一级结构分析显示相对分子量为82009.8Da,理论等电点pI为5.41,碱性氨基酸（Arg+Lys）共有118个,酸性氨基酸（Asp+Glu）共有139个,分子式为C6289H10440N2134025768471。理化性质分析显示没有O型糖基化修饰位点；有3个N型糖基化位点；有17个丝氨酸的磷酸化位点,苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点分别是9个和7个：是亲水蛋白,没有信号肽序列,属于非分泌型蛋白。二级结构分析表明,该蛋白是混合型蛋白；三级结构分析结果显示与该蛋白序列最匹配的模板是3ekoA,最佳比对区域位于PvHSP蛋白序列的第16-205位氨基酸残基,序列一致性达83.684%,e值为8.10e-86。3.实时荧光定量结果显示,在拟黑多刺蚁的各个时期hsp90基因均有表达,但mRNA表达水平有差异。在幼虫期从二龄幼虫到蛹,表达量有下降趋势,一龄幼虫表达量最低,而成虫表达量明显升高。成虫中雌蚁的表达量最高,显著高于工蚁和雄蚁,这可能与雌蚁的产卵繁殖功能及其产卵后脱翅行为有关,但具体的原因还有待于进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 前言
• 1.1 热激蛋白概述
• 1.1.1 热激蛋白的发现
• 1.1.2 热激蛋白的分类及特点
• 1.1.3 热激蛋白的作用
• 1.2 HSP90概述
• 1.2.1 HSP90的结构
• 1.2.2 HSP90调控机制
• 1.2.3 hsp90基因序列克隆和组织表达差异
• 1.3 拟黑多刺蚁概述
• 1.3.1 拟黑多刺蚁的营养价值
• 1.3.2 拟黑多刺蚁的人工饲养
• 1.3.3 拟黑多刺蚁的繁殖
• 1.3.4 拟黑多刺蚁的品级分化
• 1.3.5 拟黑多刺蚁的研究进展
• 1.4 生物信息学概述
• 1.5 实时定量技术概述
• 1.6 研究目的和意义
• 第2章 研究内容和技术路线
• 第3章 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 生物材料
• 3.1.2 仪器和设备
• 3.1.3 主要实验试剂和溶液
• 3.2 基因克隆方法
• 3.2.1 RNA的提取
• 3.2.2 反转录cDNA第一条链的合成
• 3.2.3 引物的设计与合成
• 3.2.4 基因全长cDNA序列的获得
• 3.3 生物信息学分析
• 3.4 荧光实时定量检测基因mRNA水平表达
• 3.4.1 模板的制备
• 3.4.2 引物的设计及检测
• 3.4.3 实时定量PCR检测
• 第4章 结果与分析
• 4.1 基因克隆
• 4.1.1 总RNA的提取
• 4.1.2 序列扩增所用引物
• 4.1.3 基因全长cDNA序列的获得
• 4.1.4 开放阅读框分析
• 4.2 生物信息学分析
• 4.2.1 同源性分析
• 4.2.2 功能结构域分析
• 4.2.3 系统发育分析
• 4.2.4 蛋白序列一级结构及理化性质分析
• 4.2.5 蛋白序列二级结构分析
• 4.2.6 蛋白序列三级结构分析
• 4.3 荧光实时定量检测基因mRNA水平表达
• 4.3.1 模板制备结果
• 4.3.2 引物专一性检测结果
• 4.3.3 实时定量RT-PCR检测结果
• 第5章 讨论
• 5.1 总RNA的提取
• 5.2 拟黑多刺蚁hsp90基因的克隆
• 5.3 hsp90的表达与动物发育的关系
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果