论文摘要
枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不太稳定等因素影响,其应用受到一定的限制。近年来,随着分子生物学和基因工程的发展及168菌株基因组测序的完成,枯草芽孢杆菌的研究进入了新的快速发展时期,而其作为基因工程表达系统也不断完善,并展现出良好的应用前景。同时,枯草芽孢杆菌的遗传学操作方法也在不断地更新,快捷高效的方法会大大提高研究的效率。本文旨在建立一套快捷高效的枯草杆菌遗传学操作方法,并应用其对宿主菌进行改造,以提高外源蛋白的表达效率。本文亦研究了农药降解酶的枯草杆菌孢子表面展示和野生芽孢杆菌的转化及外源蛋白表达,为农药降解酶剂型的开发和寻找新型表达系统打下了基础。现有的枯草芽孢杆菌遗传操作系统依赖于载体的构建和枯草芽孢杆菌自身的重组系统,耗时长、效率低。本文将Cre/loxP定点重组系统和重叠延伸PCR技术结合建立了一套快捷高效的枯草芽孢杆菌基因组操作方法。用重叠延伸PCR技术代替载体构建快速地将目标敲除位点的上下游同源臂和抗性标记盒融合起来,用Cre/loxP定点重组系统代替菌体自身的重组系统高效的删除抗性标记,整个操作过程可以在2天内完成,大大提高了效率。应用该方法实现了枯草芽孢杆菌的基因敲除、基因的框内删除（in-frame deletion）以及基因组大片断的删除。该方法还适用于基因组的重排（genome rearrangement）和大规模的基因敲除。为解决枯草芽孢杆菌表达系统蛋白酶问题而构建的缺失8个蛋白酶基因的WB800菌株染色体上残留了三个抗性标记（mpr::ble nprB::bsr wprA::hyg）,影响该菌株的进一步改造及工程茵的构建。我们用新建立的方法依次将这三个抗性标记删除,获得了一株“绿色的”蛋白酶缺陷株WB8003,作为后续外源蛋白表达的宿主菌。基于Cre/lox定点重组系统和PCR技术的基因敲除方法可以改造成为将外源基因整合到枯草杆菌基因组上的快捷方法,且不留下抗性标记。我们将甲基对硫磷水解酶基因（mpd）表达盒插入到WB8003的淀粉酶基因（amyE）位点,得到工程菌株BSM1。该方法可用于将多个拷贝的目的基因表达盒整合到枯草杆菌基因的不同位点,可以优先选择蛋白酶基因位点,这样在增加表达盒拷贝数的同时又能将蛋白酶基因失活,从而达到提高目标蛋白表达量的目的。枯草杆菌168基因组上groESL操纵子和gut操纵子之间有段13 kb低G+C的区域叫原噬菌体3（propha 3）,该区域含有BsuM（ydiO和ydiP）修饰系统和BsuM限制系统（ydiR,ydiS和ydjA）,限制修饰系统对质粒转化效率的影响很大。我们用新建立的遗传操作方法删除了该区域,研究了其对质粒转化效率的影响,结果显示该限制修饰系统显著影响带有XhoI位点质粒的转化效率,对没有该位点的质粒影响不大。此外,本研究发现大肠杆菌对质粒的甲基化修饰不影响其对168的转化效率。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最广泛的表达系统之一,我们在用其表达外源蛋白时往往要对宿主茵进行改造,但其现有的遗传操作方法效率较低。参照枯草芽孢杆菌中的模式,基于Cre/loxP定点重组系统和PCR技术,我们建立了一种高效快捷的毕赤酵母基因敲除方法,整个敲除过程可以在4天内完成,该方法被成功用于his4和pep4因的敲除。P.pastoris表达系统是将外源基因整合到染色体上进行表达,该方法亦可用于外源基因的多拷贝整合,提高表达量。芽孢杆菌的孢子抗逆性强、生产简单,近年来发展成为展示重组蛋白的优良载体。但研究者主要将其用于口服重组蛋白疫苗的载体,未见用于环境污染物修复的报道。目前报道的用于表面展示研究的有机磷水解酶只有OPH。在本研究中我们将本实验室分离到的有机磷水解酶MPH展示于枯草杆菌芽孢的表面。获得的重组孢子具有MPH活力,但是活力较低,离实际的应用还有很大距离,下步的工作重点是提高MPH的活力。农药的降解过程需要若干个酶的参与,孢子衣蛋白中CotB、CotC和CotG都可以作为外源蛋白展示的靶位点,可以用不同的靶位点在同一个孢子表面展示多个降解酶,将农药的降解途径从胞内转移到孢子表面。在本实验室之前的工作中发现通过将枯草杆菌模式菌株（供体茵）和野生的芽孢杆菌（受体菌）混合培养可实现不可自我转移的pUB110衍生质粒向受体菌的转移,但不知质粒通过何种方式进行转移。本研究证明野生芽孢杆菌通过形成感受态摄取供体菌释放的质粒,同时还发现质粒的存在形式和来源对野生芽孢杆菌的转化影响很大,多聚体和来源于相近种的质粒转化效率最高。并发现有些野生菌株在外源蛋白表达方面显著优于模式菌株。这为野生芽孢杆菌的转化提供了参考,也为进一步开发新的表达系统打下了基础。