四倍体刺槐再生体系优化和农杆菌介导的PIS基因转化国槐的研究

论文摘要

不良环境如低温、干旱、盐碱等非生物逆境是自然界普遍存在的影响植物生长的因素,这些能引起植物体内发生一系列的生理变化,植物必须适应这些条件才能够生存。由于抗盐耐旱植物材料的缺乏,特别是乔灌木树种的缺乏,严重制约了我国北方盐碱干旱地区生态工程建设和农村经济发展。我国有大片的盐渍土壤（约占耕地面积的75%）等待进一步的开发利用,同时,我国也是一个水资源紧缺的国家,干旱和半干旱耕地面积占全国总耕地面积的38%,如何开发和利用大面积的盐渍土或盐渍化贫瘠土地,不仅是我国增加农业可利用土地资源的需要,也是改善生态环境、增加绿色植被、提高森林覆盖率的需要。因此,我国林业生产迫切需要解决适合这些地区植树造林和植被恢复的具有较高经济效应和生态效益的种苗。由于林木树种生长周期长、个体大,采用常规育种技术改良林木的抗逆性工作量大、年限长,导致林木优良品种的培育工作进展缓慢,难以满足生态建设和经济发展的需求。但是,现代生物技术的发展为培育抗逆的作物品种提供了新方法和途径,已经成为改良盐碱地经济而有效的手段。四倍体刺槐和国槐是优良的多用途树种,我国各地均有栽培,具有重要的生态和经济利用价值。如能提高抗逆性,对退耕还林、发展畜牧业和改善生态环境具有十分重要的意义。本研究主要优化四倍体刺槐再生体系,为基因工程育种奠定良好的基础;同时利用PIS基因所具有的对干旱、盐碱的抗御功能,以农杆菌为介导将其导入国槐中,以期获得抗旱、耐盐的新品系,加大推广面积,改善生态环境。目前取得的主要研究结果如下:1、四倍体刺槐再生体系的优化以四倍体刺槐茎段为材料,接种于附加不同浓度卡那霉素（Kanamycin）的CNB（MS+1.8mg/L NAA+1.1mg/L 6-BA）培养基上,当Kan浓度达到50mg/L时,愈伤组织明显膨大、疏松,不定芽的诱导和生长几乎完全受到抑制,50mg/L为筛选致死浓度;培养基中的激素种类和浓度对四倍体刺槐不定芽的诱导有明显影响,以CNB培养基培养10d后,转入附加50mg/L卡那霉素的DN培养基（含有一定浓度NAA、6-BA、ZT、2,4-D的MS培养基）上,通过两步诱导法,既提高了芽分化率（94%）,又达到了筛选的目的。2、PIS基因转化国槐的研究利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将PIS基因转入国槐中。结果表明:（1）适宜外植体为接触培养基吸收较多营养而形成的肥厚大叶片;大叶片无需预培养;（2）用液体分化培养基活化农杆菌,适宜侵染浓度OD600为0.3;（3）农杆菌侵染,将大叶片放于制备好的农杆菌菌液的培养皿中,其中农杆菌菌液量以刚好浸没叶片为准,用刀片划伤叶片,在菌液中浸染1015min;（4）最佳共培养时间3d、共培培养基pH为5.5;（5）最佳暗培养时间为1520天,即大叶片从农杆菌浸染后开始到转入再生培养基中的1520天内放置在黑暗条件下培养,之后进行正常的昼夜光照周期培养,光照时间14h.d-1;（6）转化植株鉴定,用PCR和PCR-Southern方法对获得的转化植株进行检测,确定外源基因PIS已经整合到植株基因组中;（7）转化植株培育,将确定的转化植株继代培养2025天后,取健壮小苗直接转入生根培养基中,1015天,95%以上发育成健壮的生根幼苗。利用基因枪法介导基因转化,结果表明:（1）最佳外植体渗透处理时间为24h,甘露醇浓度为0.1mol/L;（2）低温处理最佳时间为12h。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 植物遗传转化方法
• 1.1 农杆菌介导法
• 1.2 基因枪法
• 1.3 PEG 法
• 1.4 电激法
• 1.5 显微注射法
• 1.6 花粉管通道法
• 1.7 超声波法
• 1.8 激光微束法
• 2 林木基因工程研究进展
• 2.1 四倍体刺槐组织培养研究进展
• 2.2 国槐组织培养研究现状
• 2.3 PIS 基因的研究现状
• 3 本研究的目的和意义
• 4 技术路线
• 第二章 国槐转PIS 基因研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌介导的遗传转化
• 1.2.2 基因枪法介导基因转化
• 1.2.3 转化植株的PCR 和PCR-Southern 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 根癌农杆菌介导的遗传转化的优化
• 2.1.1 外植体类型对转化效率的影响
• 2.1.2 不同菌株和侵染浓度对转化效率的影响
• 2.1.3 预培养时间对转化效率的影响
• 2.1.4 侵染时间对转化效率的影响
• 2.1.5 抽真空对转化效率的影响
• 2.1.6 共培养时间对转化效率的影响
• 2.1.7 共培养基不同处理方式对转化效率的影响
• 2.1.8 暗培养时间对转化效率的影响
• 2.2 基因枪法介导基因转化
• 2.2.1 外植体不同处理方式对转化效率的影响
• 2.3 转基因植株的PCR 和PCR-Southern 检测
• 2.4 转基因植株的生根研究
• 第三章 四倍体刺槐再生体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物激素本试验所用的植物激素
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 无菌外植体的获取
• 1.2.2 培养条件
• 1.2.3 评价指标
• 1.2.4 试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素对茎段愈伤组织诱导的抑制作用
• 2.2 不同培养基对茎段愈伤组织诱导和芽分化的影响
• 2.3 不同时间添加卡那霉素对茎段愈伤组织和芽分化的影响
• 3 讨论
• 3.1 植物激素的作用
• 3.2 抗生素浓度的确定
• 3.3 大叶片的选择
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介
• 指导老师简介
• 图版一 四倍体刺槐再生体系优化图片
• 图版二 国槐转PIS 基因图片