论文题目: 胃癌中肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化及TGFβ/Smad信号传导系统表达的初步研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 董剑
导师: 彭志海,李继坤,陈国庆,徐军明
关键词: 胃癌,肿瘤相关基因,启动子岛,甲基化,蛋白表达
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 实验目的：胃癌在世界范围内是发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前胃癌发生机制的研究主要集中于分子和细胞生物学水平，包括抑癌基因在内的相关基因的失活在胃癌的发生、发展过程中发挥重要作用。基因的失活方式有很多，其中，启动子CpG岛的异常甲基化受到越来越多的重视。最近的研究证实启动子CpG岛甲基化可能在胃癌发生、发展过程中都发挥重要作用，并且是导致抑癌基因失活的重要机制。本实验通过检测10个肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化在94例胃癌癌组织和癌旁组织中的发生率，探讨上述基因的甲基化与性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移、细胞分化程度及PTNM临床分期的关系，建立胃癌较为完整的相关基因甲基化谱，为临床早期诊断胃癌提供理论依据。实验方法：应用酚／氯仿法按常规抽提组织的基因组DNA，经过亚硫酸盐处理，应用甲基化特异的PCR(methylation-specific PCR，MSP)方法检测94例胃癌癌组织、癌旁组织胃粘膜10个基因的甲基化发生率。将部分PCR产物回收，应用腺病毒载体构建重组体导入大肠杆菌中，培养后挑选克隆测序，同时测定甲基转移酶(SssI methylase)处理癌旁正常组织DNA后甲基化状态。实验结果：我们共检测了E-cad、DAPK、APC、p16INK4a、RASSF1a、hMLH1、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、COX-2和MGMT等10个基因的甲基化发生情况，我们发现E-cad、APC和RASSF1a这三个基因在胃癌组织中发生了甲基化而在癌旁正常组织中无甲基化发生，分别是E-cad为34％(32／94)，APC为23％(22／94)，RASSF1a为57％(54／94)。DAPK、hMLH1、TGFβRⅡ和p161NK4a这4个基因胃癌组织甲基化率高于相应癌旁组织，分别是DAPK为59％(55／94)和3％(3／94)，hMLH1为28％(26／94)和5％(5／94)，TGFβRⅡ为43％(41／94)和3％(3／94)，p16INK4a为45％(42／94)和23％(22／94)，均达到统计学意义(p＜0.01)。相反的是COX-2基因，胃癌组织和相应癌旁组织都有去甲基化和甲基化条带，胃癌组织甲基化率低于相应癌旁组织，并且差异达到统计学意义(p＜0.01)。男性和女性癌组织的甲基化率分别是E-cad为32％(19／59)和37％(13／35)，DAPK为56％(33／59)与63％(22／35)，APC为24％(14／59)与23％(8／35)，p161NK4a为49％(29／59)和37％(13／35)，RASSF1a为53％(31／59)和66％(23／35)，hMLH1为31％(18／59)和23％(8／35)，TGFβRⅠ为12％(7／59)和11％(4／35)，TGFβRⅡ为39％(23／59)与51％(18／35)，MGMT为15％(9／59)和17％(6／35)。9个基因基因男女甲基化率均无统计学差异。94例胃癌按年龄≤65岁和＞65岁分为两组，甲基化率分别是E-cad为35％(22／63)与32％(10／31)，DAPK为52％(33／63)与71％(22／31)，APC为27％(17／63)与16％(5／31)，p16INK4a为32％(20／63)与71％(22／31)，RASSF1a为49％(31／63)与74％(23／31)，hMLH1为24％(15／63)与35％(11／31)，TGFβRⅠ为14％(9／63)与7％(2／31)，TGFβRⅡ为43％(27／63)与45％(14／31)，MGMT为19％(12／63)与10％(3／31)。其中p16INK4a和RASSF1a的甲基化率＞65岁组高于≤65岁组，p＜0.05。94例胃癌按肿瘤位置不同将肿瘤分为1)贲门、胃底，n=12；2)胃体，n=26；3)胃窦，n=56。甲基化率分别是E-cad为33％(4／12)、35％(9／26)与34％(19／56)，DAPK为42％(5／12)、54％(14／26)与64％(36／56)，APC为33％(4／12)、23％(6／26)与21％(12／56)，p16INK4a为58％(7／12)、42％(11／26)与43％(24／56)，RASSF1a为67％(8／12)、65％(17／26)与52％(29／56)，hMLH1为33％(4／12)、27％(7／26)与27％(15／56)，TGFβRⅠ为17％(2／12)、15％(4／26)与9％(5／56)，TGFβRⅡ为50％(6／12)、46％(12／26)与41％(23／56)，MGMT为17％(2／12)、15％(4／26)与16％(9／56)。三组9个基因的甲基化率差异无统计学意义。94例胃癌根据有无淋巴结转移可分为两组，其甲基化率分别是E-cad为35％(9／26)与34％(23／68)，DAPK为46％(12／26)与55％(43／68)，APC为23％(6／26)与24％(16／68)，p16INK4a为46％(12／26)与44％(30／68)，RASSF1a为46％(12／26)与62％(42／68)，hMLH1为23％(6／26)与29％(20／68)，TGFαRⅠ为12％(3／26)与12％(8／68)，TGFβRⅡ35％(9／26)与47％(32／68)，MGMT为15％(4／26)与16％(11／68)。未发现有基因与胃癌的淋巴结转移相关。94例胃癌按肿瘤细胞分化程度分为好、中等、差三组，其甲基化率分别是E-cad为27％(12／45)、39％(14／36)与46％(6／13)，DAPK为40％(18／45)、70％(25／36)与92％(12／13)，APC为29％(13／45)、17％(6／36)与23％(3／13)，p16INK4a为40％(18／45)、56％(20／36)与31％(4／13)，RASSF1a为53％(24／45)、50％(18／36)与92％(12／13)，hMLH1为22％(10／45)、39％(14／36)与15％(2／13)，TGFβRⅠ为13％(6／45)、11％(4／36)与8％(1／13)，TGFβRⅡ27％(12／45)、50％(18／36)与85％(11／13)，MGMT为18％(8／45)、11％(4／36)与23％(3／13)。大多数基因都表现为随着肿瘤细胞分化越差其甲基化率越高，而且我们可以看出DAPK、TGFβRⅡ和RASSF1a的甲基化率与细胞分化程度明显相关，P＜0.05。94例胃癌根据PTNM分期分别分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期四组，其癌组织甲基化率分别是E-cad为26％(4／15)、27％(6／22)、36％(13／36)与43％(9／21)，DAPK为33％(5／15)、23％(5／22)、69％(25／36)与95％(20／21)，APC为13％(2／15)、36％(8／22)、19％(7／36)与24％(5／21)，p16INK4a为33％(5／15)、59％(13／22)、39％(14／36)与48％(10／21)，RASSF1a为40％(6／15)、41％(9／22)、64％(23／36)与76％(16／21)，hMLH1为27％(4／15)、32％(7／22)、28％(10／36)与24％(5／21)，TGFβRⅠ为7％(1／15)、9％(2／22)、11％(4／36)与19％(4／21)，TGFβRⅡ27％(4／15)、27％(6／22)、42％(15／36)与76％(16／21)，MGMT为7％(1／15)、18％(4／22)、17％(6／36)与19％(4／21)。九个基因中DAPK、RASSF1a和TGFβRⅡ胃癌的PTNM分期相关，随着分期的增加甲基化率随着升高，其中DAPK和TGFβRⅡ的差异明显，P＜0.01。从样本的甲基化系数分析，我们发现甲基化系数与年龄、淋巴结转移、性别和肿瘤部位没有关联。PTNM分期随Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期而增加，并且在Ⅰ，Ⅲ期；Ⅰ，Ⅳ期：Ⅱ，Ⅳ期；Ⅲ，Ⅳ期均达到统计学差异，尤其在Ⅰ，Ⅳ期有显著统计学差异。而在细胞分化好组甲基化系数低于差组，并且具有统计学意义，p＜0.05。实验结论：E-cad、DAPK、APC、p16INK4a、RASSF1a、hMLH1、TGFβRⅡ和COX-2等8个基因在胃癌中发生甲基化或者去甲基化(COX-2)，并且甲基化的水平与肿瘤细胞的分化程度、年龄、淋巴结转移和PTMN分期密切相关。目的研究TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白在胃癌审的表达，初步了解其在胃癌发生、发展中的意义。方法对本院34例胃癌患者，应用免疫组化方法分析癌组织中TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和Smad4蛋白的表达情况，表达丢失率之间采用X~2检验。结果胃癌组织中TGFβRⅠ、TGFβRⅡ和Smad4蛋白表达减低和无表达分别为6％(2／34)、32％(11／34)和12％(4／34)。胃癌组织中甲基化组TGFβRⅡ表达低于无甲基化组(P＜0.01)。结论TGFβRⅠ、TGF-βRⅡ和Smad4表达丢失可能导致了胃癌TGF-β抵抗从而促进了其发生、发展。
论文目录:
第一部分:肿瘤相关基因启动子CpG岛甲基化与胃癌相关性的研究
中文摘要
英文摘要
引言
材料与方法
实验结果
小结
第二部分:TGF-β/Smad信号传导系统在胃癌中表达的初步研究
中文摘要
英文摘要
前言
材料和方法
实验结果
小结
讨论
参考文献
综述一
综述二
致谢
附录:发表文章、参加会议
发布时间: 2007-06-28
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