泡沫病毒转录激活因子调控宿主细胞周期并受宿主细胞microRNA的调控

论文摘要

病毒是一种病原体,由于自身包装能力的限制,所以必须依赖于宿主细胞进行增殖与复制,并且对宿主细胞造成破坏。与此相反,宿主细胞在病毒进入到自身后,马上会启动其防御机制,抵抗、削弱、甚至清除病毒感染。本论文主要以泡沫病毒为研究工具,研究该类病毒对宿主细胞,特别是宿主细胞周期的抑制作用。以及宿主microRNA对病毒相关基因的调控及对病毒复制的影响。本研究还初步揭示了RNA沉默抑制因子,即番茄丛矮病毒的P19蛋白,对宿主细胞周期相关基因有显著的调控作用。Borf1蛋白是牛泡沫病毒编码的转录激活因子,可影响其自身及病毒结构基因的表达。但目前对Borf1在宿主细胞周期上是否发挥作用还不清楚。在本研究中,我们通过构建人胚肾293稳定表达Borf1的细胞系来研究其对宿主细胞的影响。研究发现,在细胞内稳定表达Borf1可显著引发细胞在G1/G0的阻滞,并且降低S期细胞的比例。用半定量RT-PCR分析发现,Borf1可在mRNA水平下调cyclin A2,cyclin B1,cyclin E1和CDC2,及上调CDK2和E2F-1的表达。蛋白水平的分析进一步核实上述结果,并且发现Borf1还可抑制P15蛋白表达。因此,Borf1通过影响周期相关蛋白表达,在G2-M及G1-S限制位点上发挥作用,进而引发细胞G1期阻抑。番茄丛矮病毒的P19蛋白不仅是一个重要的病毒致病因子,而且还可作为RNA干扰（RNAi）的抑制因子。这种作用是通过限制细胞内的小RNA,比如小干扰RNA（siRNAs）和microRNA（miRNAs）来实现。但是目前人们对P19蛋白是否可能对哺乳动物细胞产生不利影响还不知。在本研究中,我们构建了一株p19稳定表达的293细胞系,即293-p19。流式细胞仪分析发现在293细胞中过量表达P19蛋白可显著引发细胞周期的G2/M阻滞。细胞增殖实验显示293-p19细胞的DNA复制及细胞生长均受到显著的抑制。此外,研究还发现p19可使人胚肾293细胞内的细胞周期调控蛋白的表达谱发生改变。其中包括上调cyclin A1,CDK2,CDK4,CDK6,p27,cyclin D2,cyclin D3 and E2F1,及下调p15,cyclin A,cyclin B1和cyclin E1的表达。因此,我们的研究结果提示,p19有可能靶向多个周期相关调控蛋白从而引发细胞的G2/M阻滞。microRNA（miRNA）是一类大小为21-25nt的非编码RNA,在转录后水平发挥基因的抑制作用。通常microRNA可通过抑制靶序列的翻译,或引发靶序列的降解来达到其负调控目的。虽然目前microRNA分子已知的很多,但真正明确其功能的却很少。另外,有关microRNA对泡沫病毒作用的研究报道也极其有限。为此,我们利用生物信息学预测软件对人泡沫病毒（HFV）基因组进行分析,发现HFV的转录激活子Bel 1（Tas）的编码区上有一个has-miR-491-5p的靶位点。将靶序列置于EGFP基因的3’非编码区（UTR）,用化学合成的及载体表达的has-miR-491-5p均可显著抑制EGFP的基因表达。用化学修饰的特异性miRNA抑制剂及过量表达p19,均可有效解救has-miR-491-5p引发的基因抑制。研究还发现,has-miR-491-5p介导的基因抑制发生于转录后mRNA水平,而非蛋白质表达水平。不仅如此,has-miR-491-5p还可有效抑制Bel 1在质粒及病毒中的表达。该系统为进一步检测has-miR-491-5p抑制HFV病毒的复制奠定了基础。总之,病毒早期感染产生的某些重要的调控蛋白如Borf1和P19,不仅可作用于病毒基因组复制本身,而且还可作用于宿主细胞周期,通过改变周期蛋白的表达来引发细胞周期的阻抑。此外,宿主细胞对病毒的侵入性感染也呈现多种防御性作用机制,其中之一就是在细胞内引发针对病毒的miRNA介导的转录后水平的基因抑制。如miR-491对HFV Bel1蛋白的抑制作用,就有可能是宿主miRNA通过限制转录激活因子的表达抑制HFV病毒的复制。miR-491介导的这种抑制作用有可能会为病毒建立潜伏感染提供有利条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 第一节 泡沫病毒
• 1.1.1 分类与感染特点
• 1.1.2 泡沫病毒的基因组结构与病毒蛋白表达
• 1.1.3 泡沫病毒的复制周期
• 1.1.4 泡沫病毒的转录激活调控
• 第二节 病毒感染与细胞周期
• 1.2.1 细胞周期调控概述
• 1.2.2 病毒蛋白对细胞周期的G0/G1期的阻滞
• 1.2.3 病毒蛋白对细胞周期的GZ/M期的阻滞
• 第三节 病毒感染与microRNA调控
• 1.3.1 microRNA的发现
• 1.3.2 病毒相关的miRNA类型及其作用的分子机制
• 1.3.3 病毒miRNA对靶序列的选择
• 1.3.4 病毒miRNA的作用特点
• 1.3.5 宿主miRNA对病毒感染的影响
• 第四节 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 第一节 材料
• 2.1.1 菌种与细胞
• 2.1.2 抗体及其相关产品
• 2.1.3 常用试剂盒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 限制性内切酶及修饰酶
• 2.1.6 常用克隆表达载体
• 2.1.7 构建基因表达质粒
• 第二节 实验方法
• 2.2.1 外源DNA转化大肠杆菌及T-A克隆转化
• 2.2.2 煮沸法提取质粒DNA
• 2.2.3 基因组DNA的提取
• 2.2.4 细胞总RNA的抽提
• 2.2.5 细胞培养
• 2.2.6 细胞转染
• 2.2.7 稳定细胞系的建立
• 3H]胸腺嘧啶掺入实验'>2.2.8 细胞增殖检测[³H]胸腺嘧啶掺入实验
• 2.2.9 胞蛋白裂解液的制备及其浓度检测
• 2.2.10 SDS-PAGE制备与免疫印迹杂交
• 2.2.11 流式检测细胞周期及凋亡
• 2.2.12 免疫荧光实验
• 2.2.13 聚合酶链式反应
• 2.2.14 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 2.2.15 实时定量RT-PCR检测
• 第三章 结果
• 第一节 牛泡沫病毒的转录激活子Borf1影响宿主周期蛋白表达
• 3.1.1 牛泡洙病毒转录激活子Borf1可诱发细胞G1期阻滞
• 3.1.2.Borf1对细胞周期相关基因mRNA表达水平的影响
• 3.1.3.Borf1对细胞周期相关基因蛋白表达水平的影响
• 第二节 RNA沉默抑制子p19调控细胞周期相关蛋白表达
• 3.2.1 构建及检测稳定表达p19的HEK293细胞系
• 3.2.2 P19蛋白限制细胞增殖并可引发293细胞的G2/M期阻滞
• 3.2.3 P19蛋白在促细胞凋亡中的作用
• 3.2.4 P19对细胞周期相关基因的mRNA表达谱的影响
• 3.2.5.P19对细胞周期相关基因的蛋白表达谱的影响
• 第三节 宿主microRNA对泡沫病毒转录激活因子Bel1的表达抑制
• 3.3.1 人泡沫病毒的复制受宿主小RNA的调控
• 3.3.2.microRNA真核表达质粒及携带靶位点的EGFP报告质粒的构建
• 3.3.3 has-miR-491-5p在人组织中的表达谱检测
• 3.3.4.has-miR-491-5p可显著抑制pEGFP-C1-T491的表达
• 3.3.5.has-miR-491-5p对pEGFP-C1-T491表达抑制的特异性研究
• 3.3.6.has-miR-491-5p介导的基因抑制作用发生于mRNA水平
• 3.3.7.has-miR-491-5p可特异性抑制HFV病毒感染中的Bel1蛋白的表达
• 第四章 讨论
• 第一节 Borf1可负调控宿主细胞周期
• 第二节 番茄丛矮病毒的p19蛋白对动物细胞周期有负调控作用
• 4.2.1 p19对成熟促进因子（MPF）的影响
• 4.2.2 p19对cyclin A2/cdk1活性的影响
• 4.2.3 p19有可能作用于多个细胞周期蛋白调控位点
• 第三节 宿主microRNA对HFV转录激活蛋白Bel1的负调控
• 结论
• 参考文献
• 附录1 个人履历
• 附录2 在学期间完成的论文
• 致谢