中间锦鸡儿油酸脱氢酶（FAD2）基因克隆及酵母表达调控的研究

论文摘要

中间锦鸡儿（Caragana intermedia）广泛分布于我国西部、西北部干旱地区,具有改良土壤和保持水土等重要生态价值。为了在兼顾生态价值的同时创造更大的经济价值,结合中间锦鸡儿种子油脂含量较高的特点,对其脂肪酸生物合成进行研究,探讨内在的调控机理,对培育抗寒性强、油脂品质高的锦鸡儿优良新品种具有重要的意义和价值。本研究采用RT-PCR和RACE方法从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆了多不饱和脂肪酸合成的关键酶——油酸脱氢酶（FAD2）基因;采用DNAMAN、DNAStar软件及http://www.us.expasy.Org、http://www.ch.embnet.org等网络资源分析了4个FAD2蛋白的二级结构特征、蛋白质修饰等生物学特性;通过定量PCR的方法研究了FAD2基因在组织中的表达谱,并将3个FAD2基因转化酵母,从mRNA、蛋白、产物三个水平对其进行表达、调控分析,初步探讨了其内在的调控机理。主要研究结果如下:1.从中间锦鸡儿未成熟种子中克隆了3个Δ12脂肪酸脱氢酶基因,分别命名为FAD2-2A、FAD2-1A和FAD2-1B（GenBank No. EF503621、EU433557、EU433558 ）。对这三个基因以及本实验室前期研究过的中间锦鸡儿CaFAD2基因（GenBank No. AY957394,本文中命名为FAD2-2B）进行同源性比较分析可知,FAD2-1A与FAD2-1B同源性很高, FAD2-1A编码的前283个氨基酸与FAD2-1B蛋白的同源性高达98.9%,前者比后者多编码97个氨基酸,全长基因编码氨基酸的同源性为70.71%。FAD2-2A与FAD2-2B的氨基酸序列同源性也较高,为81.6%。FAD2-2B与FAD2-1A的氨基酸序列同源性最低,为64.7%。2.生物信息学分析表明,4个蛋白中只有FAD2-2B有信号肽,其余3个都没有信号肽剪切位点。二级结构FAD2-2A与FAD2-1A相似,以无规卷曲为主,含少量直链,间或有α螺旋;FAD2-2B与FAD2-1B相似,主要以无规卷曲和直链为主。4个蛋白是典型的膜结合蛋白,都有56个跨膜疏水区。在蛋白的稳定性方面,FAD2-2A蛋白半衰期是220h,其余的半衰期仅30h或31h;在蛋白翻译相对效率方面,FAD2-2B为1,其余3个均为5。FAD2-1A、FAD2-1B、FAD2-2A和FAD2-2B四个蛋白的棕榈酰化位点分别是5、4、8和9个。3、Southern检测结果表明,在中间锦鸡儿基因组中FAD2基因至少有4个拷贝。FAD2-2A、FAD2-1A、FAD2-1B三个基因的荧光定量PCR结果显示,FAD2-2A基因在根和发育中期、后期种子中低水平表达,在幼嫩的茎、叶以及发育早期的种子中高水平表达。FAD2-1A基因在根中的表达量最低,在种子发育早期、中期大量表达,在幼嫩叶子中表达水平也较高。FAD2-1B基因仅在种子发育中期大量表达,别的组织、发育阶段表达量都保持在本底水平。在不同组织以及种子的不同发育时期,FAD2-1A表达量的变化幅度最大,达到了近100倍,FAD2-1B次之,FAD2-2A的变化幅度最小。结合序列比对分析我们推断:FAD2-2A基因可能主要负责合成膜脂中亚油酸,FAD2-1A主要负责种子及叶子贮脂中亚油酸的合成,FAD2-1B负责种子贮脂中油酸去饱和作用。4、通过双酶切将FAD2-2A、FAD2-1A和FAD2-1B三个基因构建到酵母表达载体pYES2中转化酵母。20℃诱导表达菌株样品的定量PCR、SDS-PAGE以及脂肪酸含量三个层次的分析可见,FAD2-2A基因在诱导表达的前期转录水平迅速增加,后期表达量保持平稳,蛋白质、产物与转录水平变化趋势一致;FAD2-1A基因表达的3个层次上的变化趋势也一样,都是表达量逐渐升高,且升高速度在整个过程中比较均衡; FAD2-1B的三个表达层次都表现出初期少量表达,中期表达量迅速增加的趋势。5、进行15℃低温处理后,FAD2-2A、FAD2-1A表达量在三个层次都有明显升高,FAD2-1A的升高幅度比FAD2-2A小;FAD2-1B转录水平略有升高,但蛋白和产物水平都没有明显变化。在受到高温胁迫时,FAD2-2A、FAD2-1A基因表达在三个层次都表现出先升高后降低的趋势,FAD2-1B转录水平和产物水平都是先升高后降低,但蛋白水平无明显变化。6、三个处理温度下基因表达三个层次的分析表明,FAD2-2A、FAD2-1A在各处理条件下的表达调控可能主要通过转录调控机制实现。FAD2-1B基因在20℃条件下主要是转录水平调控,在低温条件下可能是通过转录和翻译调控来共同实现的,而高温条件下可能是通过转录、翻译以及翻译后三个层次进行调控的。7、在温度条件变化时,FAD2-2A基因感应外界条件变化的速度最快,最先出现表达量的变化,FAD2-1A次之,FAD2-1B最慢。本研究全面、完整的阐述了FAD2-2A、FAD2-1A和FAD2-1B 3个基因的表达规律,揭示了这三个基因内在的调控机理,为进一步开展中间锦鸡儿种子油脂品质的定向遗传改良,培育适合生物柴油等各种化工生产原料的新品种创造条件和提供理论基础。同时,也能为培育抗寒性强的锦鸡儿新品种奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.1.1 研究背景
• 1.1.2 研究目的和意义
• 1.1.3 项目来源与经费支持
• 1.2 国内外研究现状与评述
• 1.2.1 锦鸡儿的生物性状及研究现状
• 1.2.2 植物脂肪酸合成及其重要性
• 1.2.3 植物脂肪酸合成酶及关键基因研究
• 1.2.4 油酰磷脂酰胆碱去饱和酶（FAD2）研究进展
• 1.2.5 RACE 技术的概念及发展
• 1.2.6 酵母作为基因表达系统的研究进展
• 1.3 研究目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.4 研究技术路线
• 1.5 实验整体安排与实验相关性
• 第二章 中间锦鸡儿 FAD2 基因全长 cDNA 克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 RNA 的提取及双链cDNA 的合成
• 2.2.2 扩增获得FAD2 保守序列
• 2.2.3 5’RACE 扩增获得5’末端序列
• 2.2.4 3’RACE 扩增获得3’末端序列
• 2.2.5 FAD2 全长基因的扩增
• 2.2.6 四个FAD2 基因的同源性比较
• 2.3 讨论
• 2.3.1 中间锦鸡儿种子总RNA 的提取
• 2.3.2 RACE 技术的改进
• 2.3.3 关于中间锦鸡儿FAD2 基因家族的成员数
• 2.3.4 FAD2 基因的可能分工
• 2.3.5 FAD2 基因的同源性比对
• 2.4 小结
• 第三章 中间锦鸡儿4 个FAD2 蛋白生物信息学比较分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 研究方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 信号肽分析
• 3.2.2 蛋白二级结构分析
• 3.2.3 亲/疏水性及跨膜分析
• 3.2.4 四个FAD2 蛋白的翻译后修饰作用
• 3.2.5 四个FAD2 蛋白稳定性分析
• 3.2.6 棕榈酰化位点预测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 信号肽预测
• 3.3.2 二级结构预测
• 3.3.3 磷酸化修饰
• 3.3.4 蛋白半衰期和翻译相对效率预测
• 3.3.5 棕榈酰化位点预测
• 3.4 小结
• 第四章 FAD2-2A、FAD2-1A、FAD2-18 基因SOUTHERN 检测及其在不同组织的表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 Southern 检测
• 4.2.2 定量PCR
• 4.3 讨论
• 4.3.1 Southern 检测
• 4.3.2 FAD2 基因的表达谱分析
• 4.4 小结
• 第五章 中间锦鸡儿FAD2-2A、FAD2-1A 和FAD2-18 基因酵母表达及调控分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 酵母表达载体的构建
• 5.2.2 酵母转化
• 5.2.3 20℃下诱导外源基因表达样品分析
• 5.2.4 15℃低温处理样品基因表达分析
• 5.2.5 30℃高温处理样品基因表达分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 20℃诱导表达FAD2 基因的调控分析
• 5.3.2 低温和高温处理FAD2 基因表达调控分析
• 5.3.3 中间锦鸡儿FAD2 基因调控方式与其它物种比较分析
• 5.4 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间的学术研究
• 致谢