氧化苦参碱逆转吗啡激活的MDR1基因过表达的实验研究

论文摘要

背景P糖蛋白过表达是多药耐药形成的一个重要原因,作为MDR1基因编码的产物,P糖蛋白是大脑血脑屏障上一种ATP依赖性的药物外排泵,可以将中枢神经系统的药物主动排出。吗啡是目前临床上治疗中重度癌痛的常用阿片类药物,也是P糖蛋白的特异性底物,长期使用后,可增加MDR1mRNA的转录,并刺激P糖蛋白在脑组织和脑血管内皮细胞上大量过表达,从而促进脑内吗啡外渗,导致作用于脑内阿片受体的有效吗啡浓度降低,从而产生吗啡耐受。氧化苦参碱是从中药苦豆子中提取的一种生物碱,研究证实其可抑制多种肿瘤耐药细胞株中P糖蛋白的表达,我们在临床中发现其能够协同吗啡治疗中晚期癌痛,起到减少吗啡的用量和维持量的作用,推测其机制可能与抑制吗啡激活的MDR1基因介导的P糖蛋白过表达相关。目的培养小鼠脑毛细血管内皮细胞,检测氧化苦参碱的非细胞毒性浓度;建立体外吗啡干预细胞模型,检测吗啡用药组和空白组之间基因和蛋白表达水平上存在的差异,即MDR1a、MDR1b及其产物P糖蛋白的表达水平变化;进而吗啡联合氧化苦参碱处理细胞,观察中药对吗啡耐受的治疗的干预作用,以及各用药组和空白组之间基因和蛋白表达水平上存在的差异,探讨氧化苦参碱对吗啡激活的MDR1基因介导的P糖蛋白过表达的逆转效果,为临床治疗提供新的靶点,同时也为预防阿片类药物耐受提出新的药物配伍方案,为阿片类药物在各种疼痛中的应用提供理论基础,延长临床上吗啡的镇痛时间,从而延缓吗啡耐受的形成。方法本研究以小鼠脑毛细血管内皮细胞为研究对象,应用不同剂量氧化苦参碱对小鼠脑毛细血管内皮细胞进行72小时处理,采用MTT比色法筛选氧化苦参碱的非细胞毒性浓度;结合国内外实验用药浓度,将细胞分为4组（接受不同浓度的单药吗啡处理）,采用RT-PCR、Western blot技术检测用药组及对照组之间MDR1a和MDR1b基因和P糖蛋白表达水平的变化;将最适浓度的氧化苦参碱与吗啡联合应用处理细胞72小时,并设立吗啡单药组、氧化苦参碱单药处理组和无任何药物处理的空白组,应用RT-PCR和Western blot实验技术检测联合用药组和单药吗啡组之间、空白组和单药氧化苦参碱组之间基因和蛋白表达水平变化;通过比较分析各组实验数据结果,明确氧化苦参碱可延缓吗啡耐受形成,其机制与抑制MDR1介导的P糖蛋白过表达相关。结果1.MTT结果显示:氧化苦参碱处理细胞72小时后,当氧化苦参碱浓度≥400ug/ml时对小鼠脑毛细血管内皮细胞的生长抑制作用明显,并具有浓度依赖性,当氧化苦参碱浓度为25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml时,其对细胞生长无明显抑制作用。结合既往文献记载,确定下一步实验用的氧化苦参碱浓度为 200ug/ml。2.RT-PCR结果显示:正常情况下,小鼠脑血管内皮细胞可检测到MDR1a基因mRNA和MDR1b基因mRNA;结合国内外实验用药浓度,将吗啡设为10-7M、10-9M、10-11M3个浓度组,各组相应药物处理72小时后,细胞MDR1a基因表达水平显著增强,且增强水平与吗啡浓度呈正相关,数据统计分析各组与空白组之间差异有统计学差异（P<0.05）,而吗啡组和空白组之间MDR1b基因表达水平并未有明显变化（P>0.05）;吗啡（10-7M）联合氧化苦参碱（200ug/ml）组处理72小时后,细胞MDR1a基因表达水平显著低于单药吗啡组,两组之间差异具有统计学意义（P<0.05）。3.Western-blot结果显示:吗啡组P糖蛋白表达水平显著高于空白组,各吗啡组与空白组之间差异具有统计学意义（P<0.05）,并且吗啡联合氧化苦参碱组P糖蛋白表达水平明显要低于单药吗啡组,两组之间差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.对小鼠脑血管内皮细胞,氧化苦参碱的非细胞毒性浓度为<400ug/ml。2.MDR1a和MDR1b基因在正常小鼠脑毛细血管内皮细胞均有表达,但吗啡引起的MDR1基因过表达仅与MDR1a基因有关。3.氧化苦参碱可抑制吗啡激活的MDR1 a和P糖蛋白的过表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 对象和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 阿片类药物耐受机制的研究进展
• 综述参考文献
• 致谢