姜黄素和肿瘤坏死因子a调节Raji细胞Notch1表达与肿瘤血管新生机制的研究

论文摘要

Notch信号途径广泛存在于多种动物体内,在进化过程中高度保守,Notch信号途径通过正反馈机制主要介导细胞的分化抑制信号,决定细胞的不同分化方向。Notch信号途径在造血系统中也是传递细胞分化抑制信号。肿瘤组织中Notch分子的表达明显高于正常组织,活化的Notch受体可阻碍细胞的分化,引起细胞持续增殖而形成肿瘤。Notch信号调节血管生成,在正常和肿瘤血管生成发挥着关键作用。Notch信号途径与血管发育的多个方面有关,包括增殖,迁移,平滑肌细胞分化,血管形成和动-静脉分化。Notch信号途径连续激活,能稳定内皮细胞的迁移网络的形成,增强三维空间血管起源模型血管样结构形成,而阻断Notch信号途径能部分抑制血管网的形成。Notch1信号途径缺陷可引起血管发育缺陷。Notch信号途径与肿瘤肿瘤生长和新血管形成也密切相关。血管新生（angiogenesis）与恶性肿瘤的发生、发展及预后密切相关,目前抗血管新生成为肿瘤治疗的一种崭新的治疗策略。血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor ,VEGF）是目前所知的最强的直接作用于血管内皮细胞的生长因子,许多恶性实体肿瘤都有VEGF蛋白及VEGF mRNA的高表达,并且VEGF的表达与肿瘤的恶性程度、进展转移和预后呈显著的相关性。NF-κB的活化与新生血管生成有关,并参与肿瘤的血管形成过程。NF-κB激活能上调VEGF的表达,VEGF-C是NF-κB的靶基因。NF-κB与Notch1信号途径活性的调节也有关,Notch1通过促进NF-κB在细胞核内滞留而增强NF-κB活性。姜黄素具有明确的抗肿瘤及抑制肿瘤血管生成活性。肿瘤坏死因子α（TNF-α）是血管生成的刺激剂,诱导肿瘤血管形成。Raji细胞是从Burkin淋巴瘤患者分离的一种B细胞株,对各种抗凋亡刺激有抵抗作用,Raji细胞在细胞核内表达连续的NF-κB活性。本研究通过检测人Burkitt淋巴瘤Raji、人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞VEGF、Notch1的表达,基质胶中血管形成实验,以及姜黄素和TNF-α对VEGF、Notch1、NF-κB/P65、IκB-α蛋白表达的影响,旨在探讨姜黄素抑制肿瘤血管形成的机制,寻找姜黄素抑制肿瘤血管形成新的作用靶点。结果表明姜黄素能影响Raji细胞VEGF的表达,抑制Raji细胞、血管内皮细胞Notch1的表达而影响血管形成,抑制NF-κB/P65核移位和NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达,由此得出结论是姜黄素能通过影响Raji细胞内多种血管形成途径,而这些信号途径又相互影响,通过肿瘤细胞自分泌和旁分泌途径,从而共同抑制肿瘤血管形成。第一部分姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji细胞内VEGF的表达及对基质胶中ECV304细胞血管形成作用的研究背景和目的姜黄素是近年发现的抗肿瘤新药,在体内外有明显的抗肿瘤细胞增殖作用。血管内皮细胞生长因子（VEGF）是体内一种强效力的促血管生成因子,能直接或间接参与血管生成,在肿瘤的发生、发展及预后中具有极其重要的地位。造血系统肿瘤也可产生包括VEGF在内的各种生长因子。在人类Burkitt淋巴瘤Raji细胞可自分泌VEGF,它不仅作用于细胞自身的VEGFR ,促进肿瘤细胞自身的增殖,同时通过旁分泌作用于周围血管内皮细胞,促进其分泌造血生长因子,使肿瘤细胞增殖。TNF-α是血管生成的刺激剂,TNF-α也可以通过上调各种血管刺激剂如VEGF表达诱导肿瘤血管形成。本文通过对姜黄素和TNF-α作用Raji细胞VEGF表达及基质胶中ECV304（人脐静脉内皮细胞株）血管形成的研究,探讨淋巴瘤的转移机制。方法采用MTT法测定姜黄素的抗增殖作用, ELISA法对Raji细胞上清的VEGF定量;基质胶中ECV304细胞血管形成实验;RT-PCR检测VEGFmRNA含量。结果ELISA结果表明Raji细胞上清VEGF的含量在TNF-α组明显高于空白对照组,姜黄素组则明显低于空白对照组,两者比较有极显著差异（p<0.01）; RT-PCR半定量检测结果发现, Raji细胞内VEGFmRNA主要为VEGF165和VEGF121,在TNF-α组其含量与空白对照组比较增加,而在姜黄素组则与空白对照组比较明显降低;基质胶中血管形成实验结果表明Raji细胞上清、VEGF和TNF-α处理的Raji细胞上清在基质胶中可促进ECV304细胞血管形成,而姜黄素处理的Raji细胞上清则未见血管形成。结论TNF-α能促进Raji细胞VEGF的表达而姜黄素则抑制其表达;TNF-α和姜黄素可通过调节VEGF表达影响肿瘤血管形成。第二部分姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji、ECV304细胞内Notch1蛋白表达的研究背景和目的Notch信号途径还与肿瘤的发生、发展与转移有关,肿瘤组织中Notch分子的表达明显高于正常组织。血管内皮细胞也存在Notch蛋白及其配体的表达,Notch信号途径在血管生成过程中发挥着关键作用,其参与血管发育的多个方面有关,包括增殖,迁移,平滑肌细胞分化,血管形成和动-静脉分化。Notch信号途径连续激活,能稳定内皮细胞的迁移网络的形成,增强三维空间血管起源模型血管样结构形成,而阻断Notch信号途径能部分抑制血管网的形成。研究表明Notch1信号途径缺陷可引起血管发育缺陷。有报道VEGF能诱导Notch1及其配体基因表达,有助于动脉内皮细胞分化,选择性干扰肿瘤内的Notch信号途径是抗肿瘤血管形成的一种策略。姜黄素能抑制多种肿瘤细胞分泌VEGF,推测其也能影响肿瘤细胞和血管内皮细胞Notch1的激活而抑制血管形成,本课题通过研究姜黄素和TNF-α对Raji和ECV304细胞内Notch1表达的影响,进一步探讨姜黄素抑制肿瘤血管生成的机制。方法采用RT-PCR检测Notch1mRNA含量;流式细胞仪分析Notch1蛋白表达。结果Raji和ECV304细胞均有Notch1mRNA表达,姜黄素抑制Raji细胞内Notch1mRNA表达并呈剂量依赖的方式,而TNF-α则增加Notch1mRNA的表达;流式细胞仪检测姜黄素和TNF-α对Raji细胞Notch1蛋白表达的影响,与RT-PCR结果基本一致,同时可以看出,VEGF并不影响ECV304细胞内Notch1mRNA的含量。结论姜黄素和TNF-α可通过影响Notch1的表达影响肿瘤血管生成。第三部分姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji细胞内核因子-κB信号途径的研究背景和目的近年来的研究表明,NF-κB参与肿瘤的血管形成过程,NF-κB的活化与新生血管生成有关。VEGF、TNF-α和血小板激活因子均能激活内皮细胞NF-κB信号途径参与血管形成,抑制NF-κB激活可抑制基质胶中血管形成。有报道NF-κB激活能上调VEGF的表达,VEGF-C是NF-κB的靶基因。Notch1信号途径与NF-κB活性的调节也有关,Notch1通过促进NF-κB在细胞核内滞留而增强NF-κB活性,Notch1是如何介导NF-κB激活目前还不清楚。Raji细胞在细胞核内表达持续的NF-κB活性,因此我们选用Raji细胞作为研究对象,通过检测细胞内NF-κB/P65和NF-κB抑制蛋白IκB-α的表达,进一步探讨姜黄素和TNF-α作用Raji细胞后NF-κB激活状态,明确姜黄素抑制肿瘤血管形成的机制。方法采用免疫印迹法检测和流式细胞术分析NF-κB/P65和NF-κB抑制蛋白IκB-α表达的变化。结果TNF-α能诱导Raji细胞IκB-α蛋白降解,P65蛋白核移位,激活NF-κB;而姜黄素以时间和浓度依赖方式抑制IκB-α蛋白表达,并抑制TNF-α能诱导的P65核移位。结论姜黄素和TNF-α可通过影响NF-κB途径信号途径影响肿瘤血管形成。

论文目录

• 论文摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文 姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji 细胞Notch1 表达与肿瘤血管新生机制的研究
• 前言
• 第一部分 姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji 细胞内VEGF 的表达及对基质胶中ECV 细胞血管形成的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji、ECV304 细胞内Notch1 蛋白表达的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 姜黄素和肿瘤坏死因子α调节Raji 细胞内核因子-κB信号途径的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 附录 博士研究生学习期间发表的文章
• 致谢