工业龟裂链霉菌G6PDH基因敲除和自身抗性基因增强提高土霉素生物合成策略研究

论文摘要

土霉素（Oxytetracycline, OTC）是在动物和水产品饲料中应用广泛的重要抗生素,基因调控策略是提高抗生素生物合成的有效方法之一。为此,本论文以工业土霉素产生菌-龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）为研究对象,分别通过初级代谢途径关键酶改造和增强自身抗性基因剂量方法,研究提高土霉素（OTC）生物合成的策略。基于初级代谢途径的改变可能会触发次级代谢水平以及细胞生理变化,且结合本实验室以前通过龟裂链霉菌模式菌株M4018中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH）失活来增加土霉素产量的研究,本论文研究了G6PDH编码基因zwfl失活对龟裂链霉菌工业菌（SRI）的影响,得到如下结果：（1）构建得到一株G6PDH失活的土霉素高产菌株S-z8,其OTC产量较原始出发菌株SRI提高36.2%；（2）将SRI与S-z8发酵生理代谢比较,发现细胞生长到第6天时,SRI的生物量较S-z8高90%,而两者的耗糖速率却没有显著差异。另外,本论文从次级代谢角度出发,研究SRI自身抗性基因otrA与otrB拷贝数增加对土霉素生物合成影响。得到如下结果：（1）通过位点特异性整合将otrA和otrB分别整合到SRI染色体上,构建筛选得到一株OTC高产突变株S-B80；（2）SRI与S-B80两株菌株土霉素对于底物的得率YP/s（mg/g）, S-B80比SRI高81.83%；生物量对于底物的得率Yx/s（mg/g） S-B80却较SRI降低了38.58%；（3）摇瓶发酵表明,S-B80胞内OTC浓度较SRI降低13.8%,同时S-B80胞内外OTC浓度总和比SRI高14.2%,说明otrB拷贝数增加可提高细胞外排土霉素至胞外的能力,也具有提高土霉素生物合成的作用。因此,通过分别对初级代谢中zwfl基因的失活和OTC自身抗性基因otrB拷贝数增加,都能有效提高土霉素的生物合成,为实际工业生产提供了重要基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1.1 龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）
• 1.2 土霉素（Oxytetracycline）
• 1.2.1 土霉素结构
• 1.2.2 土霉素生物合成基因簇
• 1.3 次级代谢产物合成调控进展
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 提高次级代谢产物产量的方法
• 1.4 zwf基因
• 1.4.1 zwf基因概述
• 1.4.2 zwf基因研究进展
• 1.5 抗性基因（Self-resistance gene）
• 1.5.1 抗生素产生菌自我保护机制
• 1.5.2 抗性基因otrA与otrB
• 1.6 本文研究背景、研究内容和研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.1.5 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的甘油管保存
• 2.2.2 分子生物学实验
• 2.2.3 重组菌发酵培养
• 2.2.4 菌种生理特性的测定
• 第三章 工业龟裂链霉菌zwf1基因中断对土霉素生物合成的影响
• 3.1 引言
• 3.2 结果
• 3.2.1 部分zwf1基因片段的获得
• 3.2.2 交换载体pKC1139-zwf1的构建和去甲基化
• 3.2.3 转化子形态观察
• 3.2.4 转化子PCR鉴定
• 3.2.5 突变子S-z8发酵
• 3.2.6 突变株生长特性
• 3.3 讨论
• 3.3.1 zwf1基因敲除对生物量形成和土霉素生物合成影响
• 3.3.2 通过初级代谢调控提高刺激代谢产物产量研究
• 3.4 本章小结
• 第四章 龟裂链霉菌工业菌otr基因增强菌株构建及鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 结果
• 4.2.1 pSET152-otrA/pSET152-otrB构建与去甲基化
• 4.2.2 pSET152-otrA/pSET152-otrB电转化龟裂链霉菌工业菌
• 4.2.3 重组菌整合方式鉴定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 通过增强抗性提高抗生素产量研究
• 4.3.2 抗生素合成基因与耐药基因的协调表达效应
• 4.3.3 龟裂链霉菌自我保护机制
• 4.4 本章小结
• 第五章 otr基因增强对龟裂链霉菌工业菌土霉素生产及生理特性的影响
• 5.1 引言
• 5.2 结果
• 5.2.1 OTC高产菌株筛选
• 5.2.2 OTC高产菌株生理特性研究
• 5.2.3 土霉素抗性比较
• 5.2.4 胞内外OTC浓度比较
• 5.3 讨论
• 5.3.1 突变株的菌体形态变化
• 5.3.2 抗性基因增强对土霉素合成与细胞生长的影响
• 5.3.3 通过提高菌体抗性增加抗生素产量
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 在校期间发表论文
• 致谢