侵染萝卜的dsRNA病毒研究 ——带病毒萝卜的组织培养、细胞和分子生物学研究

论文摘要

萝卜（Raphanus sativus）是一种十字花科蔬菜,具有重要的食用和药用价值。上世纪七八十年代,Natsuaki等在日本的一种萝卜品种首先发现了双链RNA（dsRNA）病毒,命名为萝卜黄边病毒（radish yellow edge virus,RYED）,该病毒后来被分类到Partitiviridea的Alphacryptovirus。本实验室观察到杭州市栽培的一点红萝卜品种普遍具有黄边症状并对此进行了系统研究,我们先后在一点红萝卜中分离得到属于双分病毒科（Partitiviridea）的三种dsRNA病毒,分别命名为Raphanus sativus virus 1（RasV1）、Raphanus sativus virus 2 （RasV2）和Raphanus sativus virus 3（RasV3）,并对其基因组结构特征进行了分析。本研究从不同地区收集不同品种的萝卜种子在温室栽培,部分植株表现出轻微的症状,如黄边、轻微花叶或斑驳,轻微皱缩、叶片翻卷等。dsRNA抽提分析结果显示,所有品种的萝卜叶组织中均提取到dsRNA条带。因此,继续对上述三种潜隐性dsRNA病毒进行了细胞和分子生物学研究。取得如下结果:⑴鉴于双分病毒科病毒不能通过嫁接或摩擦接种,无已知的自然传播介体,种子和花粉传播可能是唯一已知的传播方式,本研究首先建立了萝卜的组培体系,以期获得拟研究萝卜材料的无性繁殖系。对外植体选择进行优化,选取无菌幼苗的顶芽诱导丛生芽,扩繁后诱导生根,经过炼苗移栽获得完整成活植株。萝卜组培过程中发现,以MS+0.01mg/L NAA+6.0mg/L 6-BA+3.0mg/L AgNO3为丛生芽诱导培养基效果最好,诱导率达100%;采用MS培养基或者1/2MS +1.0mg/L NAA作为诱导生根培养基,成功率40%以上;穴盘炼苗对获得成株萝卜起关键作用,采用全温室土或者1/3珍珠岩+2/3温室土的炼苗基质,成活率最高,达60%以上。⑵对一点红萝卜组培苗进行dsRNA抽提分析和斑点杂交,建立了一点红萝卜中dsRNA病毒检测体系,并筛选出只带有RasV1、带有RasV1和RasV2以及只带有RasV3的无性繁殖系,对其进行扩繁,诱导生根进行移栽,获得大量同质的组培再生植株。⑶对带有RasV1、带有RasV1和RasV2以及只带有RasV3的一点红萝卜组培植株进行组织超薄切片电镜观察,结果显示:寄主细胞结构正常,叶绿体片层结构排列整齐,没有异常的空泡化现象。但是,被RasV1侵染的萝卜叶绿体膨胀变圆,不同于常规的梭形,且在叶绿体中发现晶格状物质;在RasV3侵染的萝卜叶绿体中同样发现这种晶格状物质,推测可能是病毒基质,或者病毒诱导的某种植物蛋白过表达产物。利用组培扩繁的萝卜植株进行光合生理的比较研究,叶绿素含量、光合气体交换参数和叶绿素荧光诱导动力学参数测定结果表明,三类植株的叶绿素含量差别不显著;被RasV1侵染的植株净光合速率值（Pn）在各时期均高于带有RasV1和RasV2以及只带有RasV3的植株,而胞间CO2浓度值（Ci）相反,气孔导度值（Gs）和蒸腾速率值（E）变化不显著,推测这一现象是非气孔限制因素在起作用;PSII潜在量子效率指标（Fv/Fm）,PSII有效光化学量子产量（Fv’/Fm’）,PSII实际量子产量（ΦPSII）、光化学淬灭系数（qp）和非光化学淬灭系数（NPQ）差别不显著,推测不同的dsRNA病毒对寄主光系统II（PSII）反应中心不产生明显破坏作用,或者破坏程度一致。在叶绿体中观察到的晶格状物质对寄主光合作用有无影响还有待进一步研究。⑷利用已知植物miRNA芯片的杂交检测萝卜miRNA的结果表明:以1450条植物miRNA为探针检测到545条成熟miRNA（含miRNA*）。依据Sanger miRbase15.0版本登陆的miRNA序列进行同源性分析,所检测到的miRNA分布在31个植物物种中,其中198条为数据库中已报道的十字花科miRNA（含miRNA*）,分布在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Brassica napus）和芜菁（Brassica rapa）3个物种,40个miRNA家族。本研究首次采用对萝卜中的miRNA进行了检测,为进一步研究dsRNA病毒侵染与寄主互作的基因调控机制研究提供了条件。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 侵染萝卜的dsRNA 病毒概述
• 1.1.1 萝卜黄边症状及相关研究
• 1.1.2 一点红萝卜中的双分病毒科病毒研究现状
• 1.2 萝卜组织培养的研究与应用
• 1.3 病毒侵染对寄主植物亚细胞结构和光合作用的影响
• 1.3.1 病毒侵染后寄主亚细胞结构的病理变化
• 1.3.2 病毒侵染对寄主光合作用的影响
• 1.4 植物miRNA 研究
• 1.5 研究内容及目标
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 研究目标
• 第二章 萝卜组织培养体系的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.1.3 实验试剂
• 2.1.4 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 外植体的选择与优化
• 2.2.2 诱导分化丛生芽的培养基筛选
• 2.2.3 诱导生根和移栽的条件筛选
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 萝卜组培苗的双链RNA 病毒检测
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂和设备
• 3.1.3 dsRNA 提取分析
• 3.1.4 斑点杂交
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 dsRNA 分析
• 3.2.2 组培萝卜样品斑点杂交检测结果
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 带病毒萝卜的细胞超微结构观察和光合特征比较
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.1.4 透射电镜样品制作和观察
• 4.1.5 叶绿素含量的测定
• 4.1.6 植株叶片光合气体交换参数的测定
• 4.1.7 叶片荧光诱导动力学参数测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 带不同dsRNA 病毒的一点红萝卜细胞超微结构观察
• 4.2.2 带不同dsRNA 病毒一点红萝卜叶绿素含量比较
• 4.2.3 带不同dsRNA 病毒的一点红萝卜光合气体交换参数比较
• 4.2.4 带不同dsRNA 病毒的一点红萝卜荧光诱导动力学参数比较
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 萝卜miRNA 的初步研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 总RNA 提取
• 5.1.3 芯片杂交
• 5.1.4 信号检测与数据分析
• 5.1.5 部分miRNA 靶标预测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 一点红萝卜总RNA 提取结果
• 5.2.2 芯片杂交结果
• 5.2.3 植物保守性miRNA 在一点红萝卜中的表达
• 5.2.4 一点红萝卜miRNA 保守性分析
• 5.2.5 部分保守miRNA 靶标预测
• 5.3 小结与讨论
• 总结与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢