L-丝氨酸产生菌的选育及发酵条件优化

论文摘要

尽管L-丝氨酸（L-Serine）属于非必需氨基酸,但由于它在生物体内具有许多重要的生理功能,并可作为多种有用化合物的前体,因此,它在化工、制药、化妆品及食品等工业及科学研究中有着广泛的用途。本论文涉及野生型L-丝氨酸产生菌的筛选、菌株的遗传育种及摇瓶发酵条件的优化等研究内容。主要研究内容和结果如下:（1）采用纸层析法对发酵液中L-丝氨酸进行了定性、定量分析,绘制出了L-丝氨酸的标准曲线,并推导出了通过测定吸光度来计算发酵液中L-丝氨酸和甘氨酸含量的计算公式。研究发现该法具有较高的准确度和精密度,并且操作方便、易于掌握,非常适合在L-丝氨酸产生菌筛选中应用。（2）从自然界中筛选得到一株野生型L-丝氨酸产生菌A3,它能把20g/L的甘氨酸转化为1.40g/L L-丝氨酸。并对该菌株生理生化特征进行了较为详细的研究,对照伯杰氏细菌学鉴定手册,初步鉴定该菌株为微球菌属。（3）以野生型L-丝氨酸产生菌—微球菌A3为出发菌株,采用DES和紫外诱变,分别以磺胺胍（SG）、甘氨酸、乙硫氨酸（Eth）三种物质为药物抗性,最后筛选获得了一株L-丝氨酸产生菌S63-31 （SGrGlyrEthr）,在未经优化的条件下,L-丝氨酸发酵产量为6.5g/L。（4）对L-丝氨酸产生菌S63-31的发酵条件进行了优化研究,确定了最佳种子培养基组成为（g/L）:葡萄糖20,玉米浆25,（NH4）2SO4 10,KH2PO4 1,MgSO4·7 H2O 0.2,CaCO3 20,pH7.07.2。最佳种子培养条件:装液量为40mL/250mL圆底三角瓶,摇瓶转速为100次/min,培养温度为31℃,种龄为10h,接种量为8%。最佳发酵培养基组成为（g/L）:甘氨酸20,（NH4）2SO4 15,KH2PO4 2, MgSO4·7 H2O 0.4,玉米浆15,CaCO3 20,pH 8.0。并发现添加适量的丙二酸、苏氨酸和低浓度的SDS有利于L-丝氨酸的积累。最佳摇瓶培养条件:装液量为15mL/250mL圆底三角瓶,摇瓶转速为100次/min,振幅90mm,培养温度为31℃,发酵周期为72h。菌株S63-31在优化条件下的L-丝氨酸产量（7.36g/L）比初始条件下（6.5g/L）提高了13.23% ,L-丝氨酸对甘氨酸的摩尔转化率为26.27%。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 L-丝氨酸的理化性质
• 1.3 L-丝氨酸的用途
• 1.4 L-丝氨酸的生产方法
• 1.4.1 提取法
• 1.4.2 化学合成法
• 1.4.3 发酵法生产 L-丝氨酸
• 1.4.4 酶法生产 L-丝氨酸
• 1.5 发酵法生产 L-丝氨酸的研究实例
• 1.5.1 直接发酵法生产 L-丝氨酸
• 1.5.2 前体发酵法生产 L-丝氨酸
• 1.6 国内外 L-丝氨酸的生产概况
• 1.7 本论文研究意义及主要研究内容
• 第二章 发酵液中 L-丝氨酸和甘氨酸测定的研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 主要试剂配制
• 2.2.3 方法
• 2.2.3.1 定性测定 L-丝氨酸的主要步骤
• 2.2.3.2 定量测定发酵液中 L-丝氨酸和甘氨酸的含量
• 2.2.3.3 相对标准偏差
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 层析溶剂的选择
• 2.3.2 洗脱液最佳吸收波长的测定
• 2.3.3 最佳洗脱时间的测定
• 2.3.4 L-丝氨酸（或甘氨酸）标准曲线的测定
• 2.3.5 精密度试验
• 2.3.6 回收率试验
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 L-丝氨酸产生菌的筛选与鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器设备
• 3.2.3 培养基
• 3.3 方法
• 3.3.1 菌株筛选
• 3.3.1.1 样品采集
• 3.3.1.2 样品处理
• 3.3.1.3 L-丝氨酸产生菌的筛选
• 3.3.2 菌株鉴定
• 3.3.2.1 菌落形态鉴定
• 3.3.2.2 细胞形态鉴定
• 3.3.2.3 菌种生理生化试验
• 3.3.2.4 对碳源和氮源的利用情况
• 3.3.3 分析方法
• 3.3.3.1 pH 测定
• 3.3.3.2 L-丝氨酸的测定
• 3.3.3.3 菌体生长测定
• 3.4 结果和讨论
• 3.4.1 结果
• 3.4.1.1 L-丝氨酸产生菌的分离与筛选
• 3.4.1.2 菌株 A3 的培养特征
• 3.4.1.3 菌株 A3 的细胞形态
• 3.4.1.4 菌株 A3 的生理生化特征
• 3.4.1.5 碳源和氮源同化结果
• 3.4.2 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 L-丝氨酸产生菌的诱变育种
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 出发菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂与仪器
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.4.1 种子培养
• 4.2.4.2 发酵培养
• 4.2.5 诱变方法
• 4.2.5.1 硫酸二乙酯（DES）诱变
• 4.2.5.2 紫外诱变
• 4.2.6 筛选方法
• 4.2.6.1 平板筛选
• 4.2.6.2 摇瓶筛选
• 4.2.7 分析方法
• 4.3 L-丝氨酸代谢途径与选育机理
• 4.3.1 L-丝氨酸合成及相关代谢途径的调节机制
• 4.3.2 L-丝氨酸的选育机理
• 4.4 结果
• 4.4.1 菌体生长曲线的测定
• 4.4.2 L-丝氨酸产生菌的选育
• 4.4.2.1 L-丝氨酸产生菌的选育谱系
• 4.4.2.2 诱变剂量的选择
• 4.4.2.3 L-丝氨酸产生菌的选育
• 4.4.3 S63-31 的遗传稳定性试验
• 4.5 讨论
• 4.6 本章小结
• 第五章 L-丝氨酸摇瓶发酵条件的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 主要试剂
• 5.2.3 主要仪器
• 5.2.4 培养基
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 种子培养基的优化
• 5.3.2 种子培养条件的确定
• 5.3.2.1 种子培养时间的确定
• 5.3.2.2 种子培养基初始pH 的影响
• 5.3.3 摇瓶发酵培养基的优化
• 5.3.3.1 添加不同碳源对产酸的影响
• 5.3.3.2 甘氨酸浓度对产酸的影响
• 5.3.3.3 添加不同浓度的甲醇对产酸的影响
• 5.3.3.4 无机氮源对产酸的影响
• 5.3.3.5 硫酸铵浓度对产酸的影响
• 5.3.3.6 有机氮源对产酸的影响
• 5.3.3.7 无机离子对产酸的影响
• 5.3.3.8 有机酸添加对产酸的影响
• 5.3.3.9 不同氨基酸添加对产酸的影响
• 5.3.3.10 表面活性剂添加对产酸的影响
• 5.3.4 摇瓶发酵培养条件优化
• 5.3.5 优化条件下摇瓶分批发酵过程曲线
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论和展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表论文清单