乙肝病毒羧基末端截短的preS2/S编码蛋白（MHBst）对端粒酶逆转录酶启动子反式激活作用的初步研究

论文摘要

目的: 分别构建HBV截短型中蛋白（MHBst）真核表达载体与带有端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子和荧光素酶的报告基因质粒,利用体外共转染实验,转入端粒酶表型不同、处于不同分化阶段的多种细胞中,通过检测荧光素酶活性,探讨MHBst对hTERT启动子的调控作用,为揭示HBV相关性疾病的发生机制提供新思路。 方法: 1.乙肝病毒截短型中蛋白在肝癌细胞中的表达及其反式激活作用研究 设计引物,PCR扩增两条长度不同的HBV截短型中蛋白基因片段,分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组表达质粒pcS2与pcTS。重组子经PCR及测序鉴定。将重组子与报告质粒pGL3-control共转染肝癌细胞系HepG2,检测荧光素酶表达强度,以验证所构建的HBV截短型中蛋白表达载体在体外的反式激活作用。为进一步研究HBV截短型中蛋白及编码基因片段对肝癌细胞的影响,将重组质粒pcS2和pcTS分别转染肝癌细胞系HepG2,经G418筛选,获得阳性细胞,通过生长曲线与集落形成试验研究MHBst对肝癌细胞的生物学特性的影响。 2.端粒酶逆转录酶启动子报告基因质粒 分别用双酶切和PCR方法从pCR-TRTP载体上获得全长hTERT启动子基因序列TRTP与5’端缺失hTERT启动子基因序列Del445（包含有HBV同源序列）,分别克隆到pGL3-basic多克隆位点上,构建真核表达载体pGL3-TRTP, pGL3-del445。重组子经酶切、PCR及测序鉴定。将重组子pGL3-TRTP/pGL3-del445分别与pRL-tk共转染不同细胞系HELF、LO2、Bel7402,通过检测荧光素酶表达强度,评估报告基因质粒中端粒酶启动子活性。 3.MHBst对hTERT启动子的调控作用

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分 构建具有反式激活作用的HBV截短型中蛋白真核表达载体
• 技术路线
• 1 材料
• 1.1 质粒与菌种
• 1.2 细胞
• 1.3 主要试剂
• 1.4 试剂盒
• 1.5 DNA分子量marker
• 1.6 PCR引物
• 1.7 一般试剂
• 1.8 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 重组子的构建
• 2.1.1 质粒DNA的制备
• 2.1.2 目的基因片断的获得
• 2.1.3 质粒pcDNA3的酶切线性化与回收
• 2.1.4 目的基因片断与载体的连接
• 2.1.5 连接产物的转化
• 2.1.6 阳性重组子pcS2与pcTS的筛选鉴定
• 2.1.7 阳性克隆的保存
• 2.2 乙肝病毒截短型中蛋白表达载体反式激活作用的研究
• 2.2.1 QIAprep Spin minprep试剂盒抽取与纯化质粒DNA
• 2.2.2 HepG2细胞培养
• 2.2.3 脂质体转染
• 2.2.4 细胞的收集与裂解
• 2.2.5 荧光素酶表达量的测定
• 2.3 稳定表达的乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌生物学特性的影响
• 2.3.1 脂质体介导HBV截短中蛋白表达载体转染肝癌细胞HepG2
• 2.3.2 阳性克隆的稳定筛选
• 2.3.3 RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达
• 2.3.4 冻存稳定筛选的阳性克隆细胞
• 2.3.5 生长曲线的测定
• 2.3.6 软琼脂集落形成实验
• 3 结果
• 3.1.重组子的构
• 3.1.1 质粒的获得
• 3.1.2 PCR扩增目的基因片断
• 3.1.3 目的基因片断和载体的酶切回收
• 3.1.4 阳性重组子鉴定
• 3.2.乙肝病毒截短型中蛋白的反式激活作用
• 3.2.1 脂质体转染
• 3.2.2.乙肝病毒截短型中蛋白对SV40启动子／增强子有反式激活作用
• 3.3.乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌细胞生物学特性的影响
• 3.3.1 阳性克隆的稳定筛选
• 3.3.2 RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达
• 3.3.3 稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的生长
• 3.3.4 稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的集落形成能力
• 4 讨论
• 第二部分 构建端粒酶逆转录酶启动子报告质粒
• 技术路线
• 1 材料
• 1.1 质粒
• 1.2 细胞
• 1.3 引物
• 1.4 主要试剂
• 2 方法
• 2.1 重组子pGL3-TRTP的构建
• 2.1.1 质粒pCR—TRTP，pGL3-basic的酶切鉴定
• 2.1.2 目的片断TRTP的获取
• 2.1.3 载体pGL3-basic线性化
• 2.1.4 目的片断TRTP与载体pGL3-basic的回收与纯化
• 2.1.5 目的基因TRTP与载体的连接
• 2.1.6 重组质粒pGL3-TRTP的转化
• 2.1.7 阳性克隆株pGL3-TRTP的鉴定
• 2.2 重组子pGL3-del445的构建
• 2.2.1 目的片断Del445的获取
• 2.2.2 质粒pGL3-basic的酶切线性化
• 2.2.3 目的基因Del445与载体pGL3-basic的连接
• 2.2.4 重组质粒pGL3-del445的转化
• 2.2.5 阳性重组子pGL3-del445的筛选鉴定
• 2.3 hTERT启动子活性的验证
• 2.3.1 原代细胞的培养
• 2.3.2 RT-PCR检测不同细胞系hTERT的表达
• 2.3.3 hTERT启动子活性的鉴定
• 3 结果
• 3.1.重组子的构建
• 3.1.1 质粒pCR-TRTP、pGL3-basic的鉴定
• 3.1.2 目的基因片断的获得
• 3.1.3 目的基因片断与载体的酶切回收
• 3.1.4 阳性重组子pGL3-TRTP、pGL3-del445的酶切筛选
• 3.1.5 DNA测序及序列分析
• 3.2.hTERT启动子活性的验证
• 3.2.1 原代细胞HELF的培养
• 3.2.2.不同细胞hTERT的表达
• 3.2.3.hTERT启动子在不同细胞系中的活性
• 4 讨论
• 第三部分 MHBst对hTERT启动子的反式激活作用的研究
• 技术路线
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 不同细胞hTERT的扩增
• 2.2 共转染实验
• 2.3 细胞的收集与荧光素酶表达量的测定
• 2.4 反义寡核苷酸封闭MHBst表达的最佳量
• 2.4.1 脂质体转染
• 2.4.2 抽提RNA
• 2.4.3 逆转录扩增实验
• 2.4.4 HBV截短中蛋白的PCR扩增
• 2.5 反义封闭
• 2.6 反义封闭后荧光素酶表达量的测定
• 3 结果
• 3.1 不同细胞hTERT的表达
• 3.2 HBV截短中蛋白对hTERT启动子的反式激活作用
• 3.2.1 共转染验证其反式激活作用
• 3.2.2 最佳反义寡核苷酸浓度
• 3.2.3 特异性反式激活作用的验证
• 4 讨论
• 小结
• 拟进展计划
• 参考文献
• 附图
• 第一部分附图
• 第二部分附图
• 第三部分附图
• 附录 质粒物理图谱
• 致谢
• 发表论文及论著目录