体外定向诱导干细胞分化为胰岛样细胞

论文摘要

目的:为糖尿病细胞替代治疗提供理想的种子细胞,分别行胎儿骨髓间充质干细胞（MSCs）、胎儿胰腺源性干细胞（PSCs）以及构建人自体基因的胚胎干细胞（SCNT-hES）向胰岛样细胞的定向诱导分化,动态观察诱导分化细胞形态的时空变化及阶段特异性抗原表达,对终末分化细胞进行定性鉴定及功能检测。 方法:（1）取自然流产胎儿的股骨、胫骨等长骨骨髓,采用全骨髓培养法,按1x106/ml的密度接种至含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中,5%CO2箱中孵育48h后换液,每3d换液1次,细胞贴壁生长呈成纤维样,1:3传代继续扩增培养,取3-8代MSCs予以2—巯基乙醇、EGF、bFGF、B27及尼克酰胺分三阶段定向诱导分化为胰岛样细胞。（2）同时取胎儿胰腺体组织,机械破碎,胶原酶及胰酶消化,离心后将单细胞悬液种植于含10%FBS及1XB27的高糖DMEM培养基中,48h后培养液改换为含2%FBS及1XB27的DMEM-F12培养液,1:2消化传代。观察加ITS-A及EGF后细胞自发分化为神经元及胰岛样结构,同时予以EGF、bFGF、B27及尼克酰胺分两阶段定向诱导分化。（3）取山东省干细胞工程技术研究中心自行建立的体细胞核移植胚胎干细胞系（SCNT-hES）,采用六阶段诱导分化:（一）用含15%FBS及2—巯基乙醇的高糖DMEM预分化3d;（二）用含15%FBS的高糖DMEM悬浮培养6d形成类胚体（EBs）;（三）EBs加入含ITS-A和纤维结合素的DMEM-F12贴壁培养6d;（四）将细胞消化接种于含N2、B27及bFGF的DMEM-F12中扩增胰前体细胞6d;（五）撤掉bFGF加入尼克酰胺促进胰岛细胞形成;（六）胰岛细胞进一步成熟。对三种不同来源的各期细胞分别进行形态学观察、双硫腙染色、免疫细胞组织化学及共聚焦显微镜免疫荧光鉴定nestin、PDX-1、insulin及glucagon的表达,并用电化学发光法定量测定胰岛素分泌量。 结果:（1）胎儿MSCs于接种后24h即可见到贴壁生长的成纤维样细胞,8—9d达到80%融合,其后进入对数生长期,细胞倍增时间为30h,诱导过程中细胞逐渐变圆,表达nestin、PDX-1、insulin和glucagon,双硫腙染色见棕红色细胞团,MSCs分化得到的胰岛样细胞胞浆胰岛素分泌量为81.3±23.6uu/ml,有一定程度葡萄糖依赖性

论文目录

• 引言
• 第一章 胎儿骨髓间充质干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果（附图）
• 1.3 讨论
• 第二章 胎儿胰腺源性干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果（附图）
• 2.3 讨论
• 第三章 应用构建人自体基因的胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛样细胞
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果（附图）
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
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