基因转染精原干细胞在受体微环境中的增殖与分化

论文摘要

在非灵长类哺乳动物睾丸中,As(Asinde)型精原细胞是精子发生的干细胞。雄性一生中精原干细胞不断分裂,一部分继续增殖进行自我更新,一部分分化最终形成精子。精原干细胞是动物体内唯一能进行遗传信息传递的干细胞。因此,精原干细胞既是干细胞生物学的重要研究对象,又是研究精子发生、制作转基因动物和研究基因功能的重要资源。精原干细胞移植技术指供体睾丸细胞可被移植到受体睾丸中,在那里重新构建生精功能。1994年,Brinster等人首次报道了精原干细胞移植的成功,被认为是研究生殖干细胞、支持细胞及其间相互作用的技术突破。之后与该技术相关的其他技术也得以迅速发展,包括干细胞富集技术、冷冻保存技术、细胞长期培养等技术。利用不同的载体遗传修饰精原干细胞与精原干细胞移植技术相结合成功地产生了转基因动物的研究为揭示精子发生过程和制作转基因动物提供了新的方法。精原干细胞移植技术有着广阔的应用前景:①将能育男性的精原干细胞移植到不育男性的生精小管内,可恢复不育男性的生精功能,使供体生精细胞分化为精子;②可为即将进行化疗和放疗的男性患者提供生育力的保护;③精原干细胞可望成为防止先天缺陷引起的致死性或高危性疾病以及进行生殖细胞基因治疗的工具;④是研究精子发生机制的有力手段;⑤非常有用于经济动物生精细胞系的保存。鉴于上述精原干细胞、移植技术及其相关操作的特点及前景,尤其是在利用精原干细胞移植术制备转基因动物方面的巨大优势,本课题将在基因转染精原干细胞,以及移植后对精原干细胞在受体微环境中的增殖与分化情况进行深入探讨和研究。本研究的实验方法,首先是提取质粒(pmaxGFP),之后分别采取传统的两步酶消化法和差速贴壁法分离并分选纯化精原干细胞.绿色荧光蛋白(GPT)基因在体外经脂质体法介导转染入供体鼠的精原干细胞,再将进行过体外转染的供体精原干细胞移植到经白消胺处理30天,去除内源性精原干细胞的受体鼠生精小管中。在睾丸移植手术进行后的不同时间点将受体鼠的睾丸切除,分别进行实体观察,以及组织形态学和核酸水平的检测,从而研究携带外源基因的供体精原干细胞移植后在受体睾丸环境中的增殖和分化行为。实验结果表明,(1)实验组移植3个月后,受体小鼠曲细精管内供体精原干细胞大量增殖并重新启动生精过程,生成了精子,且交配试验获得了正常的仔鼠,说明本实验所使用的睾丸输出管移植技术是成熟可靠的。(2)本实验中所使用的体外转染方法——脂质体法,转染效率可达10%左右,但是,因为尚未得到具有GFP稳定整合的仔鼠,所以还不清楚这种体外转染方法是否为瞬时转染,鉴于时间原因转基因后代还需做进一步的观测。由于精原干细胞在睾丸细胞中的比率非常低,体外培养尚不能象胚胎干细胞那样连续传代,加上在体繁殖周期较长都造成了本实验转染效率不高的结果,但是,克服了具体技术细节后,在精原干细胞水平做基因转染仍然是一种非常有潜力的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述及本题意义
• 一、干细胞研究进展
• 1.1 干细胞的定义及特征
• 1.2 干细胞的分类
• 二、精原干细胞
• 2.1 定义
• 2.2 形态特征
• 2.3 起源
• 2.4 SSCs的增殖、分化及细胞周期
• 2.5 SSCs与精子发生
• 2.6 SSCs的生物学特性
• 三、精原干细胞移植技术研究进展
• 3.1 精原干细胞移植研究简史
• 3.2 精原干细胞移植技术
• 3.3 精原干细胞移植技术的应用
• 3.4 精原干细胞移植潜在的问题
• 四、本题的研究内容和意义
• 五、本实验技术路线特点
• 第二部分 实验材料和方法
• 一、转基因动物制备技术路线流程比较
• 二、实验材料
• 2.1 主要仪器
• 2.2 实验动物
• 2.3 质粒
• 2.4 实验试剂
• 三、实验方法与步骤
• 3.1 质粒的准备
• 3.2 操作针的准备
• 3.3 供体睾丸细胞的分离
• 3.4 精原干细胞的差速贴壁法分选
• 3.5 精原干细胞的体外转染
• 3.6 移植受体小鼠的准备
• 3.7 睾丸细胞的移植
• 3.8 睾丸细胞移植检测
• 第三部分 结果和分析
• 一、pmaxGFP质粒的提取和鉴定
• 1.1 pmaxGFP质粒提取结果与分析
• 1.2 pmaxGFP质粒酶切检测结果与分析
• 二、精原干细胞分离和贴壁分选
• 2.1 睾丸细胞的分离结果与分析
• 2.2 精原干细胞差速贴壁分选的结果与分析
• 三、精原干细胞的体外脂质体法转染的结果与分析
• 四、精原干细胞移植
• 4.1 小鼠睾丸移植效果
• 4.2 小鼠睾丸外观体积比较
• 4.3 小鼠睾丸指数比较
• 4.4 小鼠睾丸显微镜观察结果及分析
• 4.5 PCR扩增GFP基因的结果及分析
• 4.6 小鼠睾丸石蜡切片观察结果及分析
• 第四部分 讨论和分析
• 一、关于质粒状态和准确性的讨论
• 二、关于受体及供体动物的讨论
• 三、关于精原干细胞体外转染的讨论
• 四、关于精原干细胞移植的讨论
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文