基于基因组重排技术的红法夫酵母虾青素高产株选育

论文摘要

虾青素是一种高附加值的酮式类胡萝卜素,具有极强的淬灭单线态氧和清除氧自由基的能力,在食品、医药、养殖业等方面有广阔的应用前景。用红法夫酵母生产虾青素,具有发酵周期短,易于实现高密度培养等特点而受到广泛关注。本文用基因组重排技术对红法夫酵母进行育种,筛选高产菌株。以红法夫酵母野生菌株As 2.1557作为出发菌株,经过紫外线和亚硝基胍复合诱变,以75μmol/L的二苯胺作为筛选剂,最终选育出三株虾青素高产菌株,其中虾青素产量最高的可达到1.188mg/L,较出发菌株提高了48%左右,且遗传性状稳定。对红法夫酵母的原生质体制备、再生以及融合条件进行了研究。分别考察了菌体菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度等因素对红法夫酵母原生质体制备和再生的影响,采用响应面法优化红法夫酵母原生质体制备和再生的酶解条件,在该最优条件红法夫酵母原生质体制备率和再生率之积可达到60%以上。考察了PEG浓度、融合温度、融合时间以及Ca2+浓度对红法夫酵母原生质体融合的影响,确定了红法夫酵母原生质体融合的最适条件。并分别采用紫外线灭活法和热灭活法灭活原生质体,进行灭活双亲原生质体融合实验。以复合诱变所得到的三株高产突变株以及实验室保藏的另一株抗?-紫罗酮高产突变株作为亲本株,进行基因组重排育种,第一轮通过抗性筛选融合子,第二轮中用双亲灭活原生质体融合,最终筛选得到一株高产菌株,其虾青素产量为1.950mg/L,比出发菌株提高了1.43倍,且遗传性状稳定。运用代谢通量分析的方法,分析和对比了野生菌株、基因组重排的亲本株和重排之后得到的高产株的代谢通量分布情况。结果表明:重排菌株PP途径的通量较亲本株有所减小,但是EMP途径和TCA循环的途径的通量增大;用于生物质合成的通量也略有增加;重排菌株的丙酮酸脱氢酶的反应效率依然较低,约有32%的丙酮酸分泌到胞外。相关酶活实验表明,重排菌株的丙酮酸脱氢酶的活性提高有限,而与虾青素的前体物乙酰辅酶A的生成有密切关系的柠檬酸裂解酶的活性则有显著的增加,这一结果也从一定程度上阐明了重排菌株提高产量的机理。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 虾青素
• 1.1.1 虾青素的结构与性质
• 1.1.2 虾青素的功能与应用
• 1.1.3 虾青素的生产方法和市场现状
• 1.2 红法夫酵母合成虾青素的研究进展
• 1.2.1 红法夫酵母
• 1.2.2 红法夫酵母中虾青素的合成途径
• 1.2.3 红法夫酵母虾青素高产株的选育
• 1.3 基因组重排育种
• 1.3.1 基因组重排原理
• 1.3.2 基因组重排的特点
• 1.3.3 基因组重排进行菌种性能改进的实例
• 1.4 代谢通量分析
• 1.4.1 代谢通量简介
• 1.4.2 代谢通量分析的理论与方法
• 1.5 红法夫酵母体内的丙酮酸代谢
• 1.6 本课题的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 出发菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 溶液
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 仪器和设备
• 2.2 培养方法
• 2.2.1 菌种活化
• 2.2.2 种子培养
• 2.2.3 发酵培养
• 2.2.4 代谢通量分析的分批发酵
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 虾青素的测定
• 2.3.2 葡萄糖的测定
• 2.3.3 生物量的测定
• 2.3.4 丙酮酸的测定
• 2.3.5 酶活力的测定
• 2.3.6 蛋白质浓度的测定
• 2.4 复合诱变
• 2.4.1 紫外诱变
• 2.4.2 亚硝基胍诱变
• 2.4.3 筛选剂二苯胺浓度的确定
• 2.4.4 复合诱变
• 2.4.5 突变株的稳定性检验
• 2.5 原生质体的制备和再生
• 2.5.1 菌体培养
• 2.5.2 原生质体的制备
• 2.5.3 原生质体的再生
• 2.5.4 原生质体的形成率与再生率的测定
• 2.6 原生质体的融合
• 2.6.1 原生质体的灭活
• 2.6.2 原生质体的融合与再生
• 2.6.3 原生质体融合率的计算
• 2.7 基因组重排
• 2.7.1 基因组重排的流程
• 2.7.2 第一轮原生质体融合
• 2.7.3 融合子的原生质体制备和第二轮融合
• 2.7.4 融合子的稳定性检验
• 2.8 代谢通量分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 出发菌株发酵曲线的测定
• 3.2 复合诱变
• 3.2.1 诱变剂剂量的确定
• 3.2.2 筛选剂浓度的确定
• 3.2.3 野生菌株NTG和紫外复合诱变
• 3.2.4 突变株的稳定性检验
• 3.3 原生质体的制备和再生
• 3.3.1 菌体菌龄
• 3.3.2 酶浓度
• 3.3.3 酶解时间
• 3.3.4 酶解温度
• 3.3.5 响应面法确定最适的酶解条件
• 3.4 原生质体的融合
• 3.4.1 原生质体融合的影响因素
• 3.4.2 双亲灭活
• 3.5 基因组重排育种
• 3.5.1 亲本菌株的确定
• 3.5.2 第一轮基因组重排
• 3.5.3 第二轮基因组重排
• 3.5.4 重排菌株F2-11 的稳定性检验
• 3.6 红法夫酵母代谢网络的建立和代谢通量分析
• 3.6.1 红法夫酵母的代谢网络
• 3.6.2 红法夫酵母的代谢通量平衡模型
• 3.6.3 红法夫酵母的代谢通量分析
• 3.7 红法夫酵母丙酮酸代谢相关酶活的分析
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 附录
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢