小麦全蚀病菌胞外β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及性质研究

论文摘要

小麦全蚀病是一种世界范围内普遍发生的重要根部病害和重点防治对象,给小麦生产带来重大的损失。由于全蚀病的致病机理研究还很薄弱,加之目前尚无有效的抗性品种和化学药剂,全蚀病的防治仍是小麦生产中的一大难题。小麦全蚀病菌致病机理的研究显示,病菌侵染麦根的过程,不仅与纤维素酶和木聚糖酶等细胞壁降解酶有关,还可能涉及胞外β-1,3-葡聚糖酶。因此,本研究小组对小麦全蚀病菌胞外β-1,3-葡聚糖酶进行了系统研究,其目的是为进一步全面揭示小麦全蚀病菌致病过程的细胞化学和分子生物学机理奠定基础,同时也为进一步开展抗全蚀病的生物工程研究提供理论依据。本论文在课题组前期工作的基础上,对全蚀菌产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶同工酶进行了分离纯化和酶学性质研究,取得以下重要研究结果表明: 1. 硫酸铵梯度沉淀研究发现,55%饱和度的硫酸铵就基本可以将小麦全蚀病菌液体振荡培养液中的目的蛋白全部析出。2. 小麦全蚀病菌产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶主要存在两种同工酶（β-1,3-葡聚糖酶Ⅰ和?-1,3-葡聚糖酶Ⅱ）,并且?-1,3-葡聚糖酶Ⅱ的表达量相对较大,?-1,3-葡聚糖酶Ⅰ的表达量较小。3. 粗酶液经Sephadex G-150 凝胶过滤层析分离,出现两个紫外光吸收峰,各收集部分酶活力也出现两个主要吸收峰,根据各收集部分的酶活力大小及它们在层析图谱上所出现的位置,证实粗酶液主要含有两种β-1,3-葡聚糖酶同工酶。4. 经过非变性PAGE分离胶浓度的筛选,确定了达到两种?-1,3-葡聚糖酶同工酶的最佳分离效果的分离胶浓度为7.5%。5. 电洗脱回收了经非变性PAGE（分离胶浓度为7.5%、浓缩胶浓度为3.9%）分离的同工酶（表达量较大的GluⅡ）,经电泳检测达到电泳纯。6. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ由两个亚基组成,它们的分子量分别为63.2KD 和73.7KD。7. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ的等电点为8.6。8. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ最适反应温约为50℃,在<60℃时比较稳定;最适反应pH值5.0 左右,pH4.0～7.0 较稳定;Mn2+对其酶活力有显著的激活作用,而Co2+,Hg2+对其酶活力有明显的抑制作用,Mg2+对该酶酶活力有轻微的抑制作用,Fe2+,Zn2+,Ca2+,Ba2+对酶活力基本没有影响。9. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ对昆布多糖的Km 为4.909 mg/mL , Vmax 为

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦全蚀病
• 1.1.1 小麦全蚀病的发现与国内外发生概况
• 1.1.2 小麦全蚀病菌
• 1.1.2.1 禾顶囊壳小麦变种（Ggt ）
• 1.1.2.2 禾顶囊壳禾谷变种（Ggg）
• 1.1.2.3 小麦全蚀病菌的培养特性
• 1.1.2.4 小麦全蚀病菌的生活史及侵染循环
• 1.1.3 小麦全蚀病防治研究现状
• 1.1.3.1 增施有机肥,实施健身栽培,防治全蚀病的研究
• 1.1.3.2 适期播种,轮作栽培,防治全蚀病的研究
• 1.1.3.3 化学防治小麦全蚀病的研究
• 1.1.3.4 拮抗微生物及抗生素防治全蚀病的研究
• 1.2 小麦全蚀病菌在侵染过程中与寄主的互作
• 1.2.1 病菌的生长和侵染
• 1.2.2 病原菌和寄主之间的互作
• 1.3 植物病原真菌产生的?-1,3-葡聚糖酶研究进展
• 1.3.1 植物病原真菌β-1,3-葡聚糖酶的调节
• 1.3.1.1 β-1,3-葡聚糖酶合成的诱导
• 1.3.1.2 β-1,3-葡聚糖酶合成的抑制
• 1.3.1.3 复合调节机制
• 1.3.2 真菌β-1,3-葡聚糖酶在真菌生长发育中的作用
• 1.3.2.1 营养作用
• 1.3.2.2 参与真菌细胞壁的形成和构象改变
• 1.3.2.3 参与真菌的自溶
• 1.3.3 植物病原真菌β-1,3-葡聚糖酶在致病过程中的作用
• 1.3.3.1 参与接触并粘附寄主的细胞壁
• 1.3.3.2 参与破坏包围病菌入侵组织的乳突,使真菌成功穿透寄主细胞壁
• 1.3.4 植物病原真菌β-1,3-葡聚糖酶纯化和理化性质
• 1.3.4.1 蛋白质（酶）分离纯化策略
• 1.3.4.1.1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法
• 1.3.4.1.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
• 1.3.4.1.3 根据蛋白质带电性质进行分离
• 1.3.4.2 植物病原真菌β-1,3-葡聚糖酶分离纯化的研究
• 1.3.4.3 植物病原真菌β-1,3-葡聚糖酶的一般理化性质
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和培养基
• 2.1.1.1 菌种
• 2.1.1.2 培养基
• 2.1.2 主要仪器与试剂
• 2.1.3 蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂
• 2.1.3.1 非变性及变性PAGE 试剂
• 2.1.3.2 等电聚焦所需试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌种的复壮
• 2.2.2 液体发酵培养方法
• 2.2.3 酶活力测定方法
• 2.2.3.1 底物的配制
• 2.2.3.2 DNS（显色）溶液的配制
• 2.2.3.3 葡萄糖标准曲线的制作
• 2.2.3.4 酶活力的测定步骤
• 2.2.4 蛋白含量的测定方法
• 2.2.4.1 考马斯亮蓝G-250 显色试剂
• 2.2.4.2 BSA 标准曲线的制作
• 2.2.4.3 蛋白质浓度测定
• 2.2.5 酶的分离与纯化
• 2.2.5.1 粗酶液的获得
• 2.1.5.2 粗酶液的非变性PAGE 及活性染色
• 2.1.5.3 柱层析法纯化目的蛋白
• 2.1.5.4 电泳及电洗脱回收目的蛋白
• 2.2.6 酶性质的研究
• 2.2.6.1 蛋白质分子量的测定
• 2.2.6.2 等电点测定
• 2.2.6.3 温度对酶活性的影响
• 2.2.6.4 PH 对酶活性的影响
• 2.2.6.5 金属离子对酶活力的影响
• 2.2.6.6 酶的Vmax 及Km
• 第三章 结果与分析
• 3.1 合适盐析浓度的确定
• 3.2 粗酶液的非变性PAGE 检测
• 3.3 β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ的纯化
• 3.3.1 柱层析法
• 3.3.2 -1,3-葡聚糖酶Ⅱ的电洗脱回收
• 3.4 β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ的酶学性质
• 3.4.1 SDS-PAGE 测定分子量
• 3.4.2 -1,3-葡聚糖酶Ⅱ的等电点
• 3.4.3 最适反应温度及热稳定性
• 3.4.4 最适反应及pH 稳定性
• 3.4.5 金属离子对β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ活力的影响
• 3.4.6 酶的Vmax 及Km
• 第四章 讨论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献