中国三黄鸡可溶性B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达和活性研究

论文摘要

B淋巴细胞刺激因子BAFF（B cell activating factor belonging to the TNF family），是一种B淋巴细胞的共刺激因子，属TNF超家族成员。Schneider et al．（2004）成功克隆了鸡BAFF基因，国内对鸡BAFF的研究尚未起步。中国三黄鸡是中国常见的地方品种鸡，本研究根据GenBank提供的鸡BAFF基因序列（GenBank索取号AF506010），设计引物，通过逆转录-聚合酶链式反应，首次从中国三黄鸡脾组织细胞中分别扩增得到864bp的鸡B淋巴细胞刺激因子（CycBAFF）基因和459bp的鸡可溶性B淋巴细胞刺激因子（CycsBAFF）基因片段，一方面通过大肠杆菌系统表达了CycsBAFF蛋白，并对其进行纯化，Western blot，复性和活性的鉴定；另一方面，利用巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）成功构建了重组CycsBAFF真核表达载体，为真核表达实验奠定了基础。此外，我们还制备了兔抗CycsBAFF多克隆抗体，通过间接ELISA方法检测了其效价，以及Western blot检测其与抗原的结合性。1 CycsBAFF的原核表达和活性研究将CycsBAFF片段克隆入原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21（DE3）后高效表达了带有His6标签的包涵体形式重组蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。表达产物经Ni2+-NTA纯化后，经透析复性得到活性目的蛋白，通过单独刺激以及与PMA共刺激体外培养的鸡法氏囊B细胞，经MTT法检测，均有明显的促法氏囊B细胞存活的效应。2 CycsBAFF真核表达载体的构建将扩增得到的CycsBAFF片段与毕赤酵母表达载体进行连接，得到重组载体pPIC9-CycsBAFF，线性化后转化酵母细胞GS115。3兔抗CycsBAFF多克隆抗体的制备及鉴定通过皮下注射重组CycsBAFF蛋白，制得抗CycsBAFF多克隆抗体，间接ELISA法检测抗血清效价为20000倍；并通过Western blot分析抗体的特异性。本研究为建立双抗夹心ELISA方法奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 一、细胞因子综述与人B淋巴细胞刺激因子（hBAFF）的研究进展
• 1.细胞因子综述
• 2.hBAFF的研究进展
• 参考文献
• 二、鸡B淋巴细胞刺激因子（cBAFF）的研究进展
• 参考文献
• 三、大肠杆菌与毕赤酵母表达系统
• 1.大肠杆菌表达系统
• 2.毕赤酵母表达系统
• 参考文献
• 四、多克隆抗体
• 参考文献
• 第二部分 实验研究
• 第一章 CycsBAFF的原核表达、纯化复性及活性检测
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果与分析
• 4.讨论
• 参考文献
• 第二章 CycsBAFF的真核表达载体的构建
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果与分析
• 4.讨论
• 参考文献
• 第三章 抗Cycs多克隆抗体的制备及鉴定
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果与分析
• 4.讨论
• 参考文献
• 第三部分 全文总结
• 一、研究的意义
• 二、实验总结
• 附录1 论文撰写与发表
• 致谢