论文摘要
目的：1．建立一种简单、快速并能同时测定血清中的犬尿氨酸（KYN）和犬尿喹啉酸（KYNA）的高效液相色谱一荧光检测法（HPLC-FLD）。2．探讨血液标本的采集与保存对犬尿氨酸（KYN）和犬尿喹啉酸（KYNA）测定结果的影响。3．用该方法建立正常人血清犬尿氨酸（KYN）和犬尿喹啉酸（KYNA）含量以及KYNA／KYN比值参考值范围。4．初步探讨慢性肾功能衰竭（CRF）中血清犬尿氨酸（KYN）和犬尿喹啉酸（KYNA）含量以及KYNA／KYN比值的临床意义。方法：1．血清标本与等量5％（V／V）高氯酸溶液混合处理去除蛋白后离心取上清液20μl直接进样分析。用Hypersil C8柱（300mm×6．0mm i．d．，10μm）分离；流动相为0．25 mol／L醋酸锌及50 mmol／L醋酸溶液（含3％乙腈v／v）；流速1．5ml／min；荧光检测波长：0-10 min激发波长和发射波长分别为365nm和480nm，10min后激发波长和发射波长分别变换为344nm和404nm。室温下约15分钟完成分析测定。KYN和KYNA均采用峰保留值比较法和叠加法进行定性分析，用外标法测定峰面积进行定量分析。考察了5-羟色胺（5-HT）、色氨酸（TRP）、苯丙氨酸（PHE）、酪氨酸（TYR）和肌酐（Cr）等对待测组分（KYN和KYNA）的可能干扰。2．利用高效液相色谱-荧光法检测法测定EDTA-K2抗凝血浆及血清在室温（25±1）℃、4℃、冰冻（-20℃）保存下0、24、72、120、168 h后KYN和KYNA的浓度。3．测定健康体检者（n=71例）血清KYN和KYNA含量，并计算KYNA／KYN比值，以95％可信限界定相应参数的范围。4．测定慢性肾衰竭（CRF）患者（n=76例）血清KYN、KYNA含量，探讨慢性肾衰患者不同阶段血清KYN和KYNA含量变化及其在鉴别诊断、治疗监测、机制研究等方面的临床意义。结果：1．血清和标准品样本的KYN和KYNA峰均分离良好，保留时间分别约为8．1和13．0分钟。KYN线性范围为0．098～19．6μmol／L，最低检测限为0．05μmol／L；平均回收率为94．88％，日内CV为3．87％，日间CV为3．94％。KYNA的线性范围为2．62～1047nmol／L，最低检测限为0．11nmol／L,平均回收率为102．72％，日内CV为3．79％，日间CV为4．71％。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-羟色胺和肌酐等物质对KYN和KYNA的测定均无干扰。2．EDTA-K2抗凝血浆和血清KYN和KYNA测定结果差异均无统计学意义（P>0．05）。血清标本在-20℃冰冻保存一周KYN和KYNA浓度无明显变化（P>0．05），在4℃保存一周，KYN和KYNA均有下降的趋势，但变化无统计学意义（P>0．05），在室温（25℃±1）下保存，KYN浓度在72h内尚无明显变化（P>0．05），72h后明显下降（P<0．05），KYNA浓度在120h内尚无明显变化（P>0．05），在120h后明显下降（P<0．05）。3．71例健康成人血清KYN浓度为0．95～2．82μmol／L，x±s=1．40±0．34μmol／L，血清KYNA浓度为11．79～46．69 nmol／L，x±s=24．22±8．67 nmol／L，KYNA／KYN比值为11．76～28．36（nmol／μmol），x±s=29．271±9．315。不同年龄组之间，血清KYN、KYNA含量及KYNA／KYN比值差异均无统计学意义（P>0．05）。4．与正常对照组相比，CRF组血清KYN和KYNA含量显著升高（P<0．01）；CRF组患者各阶段血清KYN和KYNA含量随病情发展升高（P<0．01）；且CRF组血清KYN和KYNA含量与肾功能状态有一定相关性。结论：1．本文建立的HPLC—FLD法可同时测定血清KYN和KYNA，方法简单、快速、灵敏、特异、准确，适宜于临床与科研工作。2．EDTA-K2抗凝血浆和血清KYN和KYNA测定结果差异均无统计学意义。血清标本在室温（25℃±1）条件下可稳定三天，若不能及时检测时，最好置于≤-20℃条件下保存。3．在国内首次使用HPLC-FLD同时测定正常人血清中KYN和KYNA含量和KYNA／KYN比值，可为相关研究工作提供参考数据。4．通过对CRF患者血清KYN和KYNA含量的测定，结果表明CRF患者血清KYN和KYNA含量随病情发展发生变化，并与血清Ur和Cr等肾功能指标相关。
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