中华蜜蜂头部cDNA芯片研制及基于芯片的抗螨性研究

论文摘要

大蜂螨（狄氏瓦螨,Varroa destructor）是严重危害西方蜜蜂（Apis mellifera,主要是意大利蜜蜂,即意蜂A.mellifera lingustica）的蜂螨,但大蜂螨对原产于我国的中华蜜蜂（中蜂,Apis ceranacerana）则没有明显的危害。其原因是中蜂为大蜂螨的原始寄主,在长期协同进化过程中,该蜂已经形成了很强的防卫机制和行为。中蜂的这种抗螨特异性是可遗传的,因此本研究在构建中蜂头部cDNA芯片的基础上,对中蜂抗螨性的分子机制进行了探索分析。主要研究内容如下:1.利用已构建好的中蜂头部cDNA文库,从8569条高质量ESTs序列中,共拼接出基本覆盖所有序列217条Contigs、788条singlets,由此获得基因芯片的1025条候选ESTs。通过PCR扩增,最终获得717条高质量ESTs。通过BLAST检索,对ESTs序列进行了功能注释,其中有功能尚不明确的ESTs 588条,功能明确的基因129条。对这129条基因进行了Gene Ontology分类,按照细胞功能（Molecular function）、生物过程（Biological process）以及细胞组分（Cellularcomponent）,将ESTs分成三类,并统计了每大类下各小类的分布情况。构建了较为完善的cDNA芯片数据库。2.对候选ESTs进行了PCR扩增和纯化,采用点样法完成了中蜂头部cDNA芯片制备。该芯片分为三个矩阵,每个矩阵又分为4个亚矩阵,每个矩阵含有717×2个ESTs探针。每张芯片设计三个矩阵既可以同时进行三次重复,也可以同时检测三个不同样品,具有高通量,操作简便等优点。对芯片扫描检测结果表明,该芯片矩阵排布整齐,探针点形状规则,直径为90.63±15.87μm,荧光背景低,无连点,2个重复点大小形状基本上一致,信号的差异系数大于0.33的低于30%,点样成功率超过97%。结果表明,该基因芯片探针点大小均一,点制的重复性好。3.标记新出房中蜂、意蜂工蜂,定期回捕后,用活蜂螨接种麻醉工蜂,笼养3日进行胁迫。分别提取四种不同处理的蜜蜂样本,包括螨胁迫中蜂组和意蜂组,中蜂对照组和意蜂对照组的头部总RNA,反转录成cDNA,并作荧光标记,两两组合后分别与中蜂头部cDNA芯片进行杂交,芯片扫描,杂交结果分析。经初步分析,筛选出了与抗螨性相关的18条差异表达ESTs,并对其中的卵黄蛋白原Vitellogenin、化学感受态蛋白ASP3和α-1,3岩藻糖基转移酶Alpha-（1,3）-fucosyltransferase C的分子机理进行了初步分析。本项研究所完成的中蜂基因芯制备和用基因芯片检测蜜蜂抗螨性两项研究,迄今国内外均未见报道,具有原创性和自主知识产权。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 中蜂抗螨行为学研究进展
• 1.1.1 前言
• 1.1.2 中蜂抗螨行为学概述
• 1.1.3 基因芯片技术概述
• 1.1.4 基因芯片的研究开发及在蜜蜂行为学上的研究应用
• 1.2 存在问题与展望
• 1.3 研究目标
• 第二章 研究内容和技术路线
• 2.1 本研究内容
• 2.2 总技术路线
• 第三章 中华蜜蜂头部cDNA芯片EST数据库的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 中蜂头部EST数据库
• 3.1.2 分析软件和网站
• 3.1.3 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 EST数据分析
• 3.2.2 EST序列功能注释
• 3.2.3 EST序列分类
• 3.3 讨论
• 第四章 中蜂头部cDNA芯片制备及质量检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 模板浓度优化
• 4.2.2 EST片段PCR扩增与纯化
• 4.2.3 芯片质量检测结果
• 4.3 讨论
• 第五章 基于基因芯片的中蜂抗螨性相关差异基因筛选
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 总RNA质量检测结果
• 5.2.2 芯片杂交结果分析
• 5.2.3 中蜂头部可能与其抗螨特性相关的基因
• 5.3 讨论
• 5.3.1 RNA质量评价
• 5.3.2 数据归一化处理
• 5.3.3 差异基因的筛选
• 5.3.4 筛选基因分析
• 5.4 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 结论
• 6.2 本研究创新点
• 6.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 硕士生期间发表的论文