线粒体铁蛋白保护由鱼藤酮引起的SH-SY5Y细胞损伤机制的研究

论文摘要

目前,帕金森病已经成为老年人中一种常见的神经退行性疾病,严重的影响着老年人的生命健康和生活质量。研究显示,一些神经毒素可以造成脑内铁代谢紊乱与氧化应激,而PD的发生和脑内铁代谢紊乱及氧化应激有着密切的关系。神经毒剂鱼藤酮是一种天然的线粒体呼吸链复合物I的抑制剂,可以引起细胞中α-synuclein和某些特异性泛素等细胞内涵物的出现,促使黑质脑区出现过多的活性氧和铁的沉积,从而选择性的导致黑质纹状体多巴胺能神经元变性死亡,因此脑铁代谢异常与神经退行性疾病的研究已经成为神经生物学和神经化学领域里十分热门的一个研究课题。细胞内游离铁过载可以对细胞产生显著的损伤作用,而细胞内普遍存在的铁蛋白可以捕获过多的游离铁以减少铁的损伤。线粒体铁蛋白（nitochondrial ferritin, MtFt）是2001年才发现的一个铁蛋白,成熟的MtFt在结构和功能上与Ferritin-H很相似,具有亚铁氧化酶活性。研究发现,MtFt与铁的结合效率比Ferritin与铁的结合效率比还要高。很多实验结果证实,过表达MtFt能够引起IRPs活性增强和TfR1表达的增加,细胞内Ferritin表达降低,最终细胞内Tf介导的铁摄取增加,细胞质中的铁向线粒体内转移,可以被MtFt捕获,MtFt的表达引起了细胞质内铁的缺乏,改变了胞质内铁的代谢平衡。也有实验证实,由于MtFt能够通过高效结合线粒体内的游离铁,保护了由frataxin基因缺陷引起的线粒体铁过载的损伤。鱼藤酮可以引起细胞内铁沉积可能是其损伤细胞而致PD发生的原因之一,而MtFt是否能够对鱼藤酮引起的多巴胺能神经元损伤具有保护作用还未见报道。我们用过表达MtFt的人成神经瘤母细胞SH-SY5Y为实验模型,pcDNA3.1-SY5Y（空质粒对照）和SH-SY5Y细胞为实验对照组,用鱼藤酮作为诱导细胞损伤的药物,运用MTT,透射电镜,流式细胞术,Western-Blot等方法研究了过表达MtFt对由鱼藤酮诱导的细胞损伤的保护作用机制,结果如下：1. SH-SY5Y细胞活力随鱼藤酮处理浓度增加呈剂量依赖性下降,当鱼藤酮处理浓度为500nM/L时,细胞活力下降50%。2. MtFt-SY5Y细胞在0-1000 nM/L各浓度鱼藤酮处理下,细胞活力均高于pcDNA3.1-SY5Y细胞和SHSY5Y细胞,差异显著。3.透射电镜下观察500nM/L鱼藤酮处理24小时,pcDNA3.1-SY5Y细胞和SH-SY5Y细胞内线粒体结构损伤严重,线粒体嵴几乎完全断裂,而MtFt-SY5Y细胞线粒体结构完整,线粒体嵴几乎没有损伤。4.500nM/L鱼藤酮处理细胞24小时,pcDNA3.1-SY5Y细胞内可变铁池（labile iron pool, LIP）显著性升高；MtFt-SY5Y细胞LIP升高没有显著性差异；鱼藤酮处理后的MtFt-SY5Y细胞LIP低于处理组的pcDNA3.1-SY5Y细胞的LIP,差异显著。5.鱼藤酮处理pcDNA3.1-SY5Y细胞24小时后,与对照组相比,细胞质铁蛋白（Ferritin-L）和膜铁转运蛋白（FPN1）表达升高,转铁蛋白受体1（TfRl）蛋白表达明显降低,差异显著。但在MtFt-SY5Y细胞中这些铁相关蛋白变化均不明显。6.500nM/L鱼藤酮处理细胞24小时后,SH-SY5Y细胞和pcDNA3.1-SY5Y细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平升高近3倍,而MtFt-SY5Y细胞ROS升高没有显著差异。7.500nM/L鱼藤酮处理细胞24小时后,SH-SY5Y细胞和pcDNA3.1-SY5Y细胞线粒体膜电位（mitochondria membrane potential, MMP）显著性降低,而MtFt-SY5Y细胞细胞MMP下降没有显著差异。8.Western Bolt显示,过表达MtFt抑制了由鱼藤酮诱导的细胞色素C的释放。结论：本研究中将MtFt转入人成神经瘤母细胞SH-SY5Y中,研究了MtFt在鱼藤酮诱导的氧化应激状态下的功能,以及与铁代谢和氧化应激的关系。1.本研究中证明,神经毒剂鱼藤酮能够引起多巴胺能神经元SH-SY5Y细胞铁蛋白Ferritin-L和LIP的升高,铁代谢紊乱是鱼藤酮引发神经元的退变的原因之一。2.本研究首次证明,MtFt可以保护神经细胞免受由鱼藤酮引起的氧化应激的损伤。其机制是MtFt过表达通过抑制鱼藤酮引起的细胞内的铁紊乱,减少过多的铁通过Fenton反应产生对细胞毒害作用的活性氧,阻止线粒体结构损伤和线粒体膜电位的降低减少细胞色素C的释放等多种途径来实现的。3. MtFt在神经细胞中的表达可以显著地降低由鱼藤酮引起的神经细胞的死亡,减少细胞内线粒体结构的损伤,对一些环境毒素引起的铁代谢紊乱的病变细胞具有很好的保护作用。结合我们最近完成并发表的研究结果,我们认为,MtFt在保护由神经毒剂诱导的细胞凋亡的过程中具有广谱性的保护作用,进一步加深了MtFt在铁代谢调节中作用的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述 鱼藤酮及铁稳态与帕金森病的关系
• 1. 鱼藤酮造成PD的发病机理
• 2. 鱼藤酮与铁代谢紊乱
• 3. 线粒体铁代谢与细胞内铁代谢的联系
• 引言
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 透射电镜观察线粒体的结构
• 2.3 MTT法测定细胞活力
• 2.4 流式细胞仪测定细胞内铁池LIP
• 2.5 流式细胞仪测定细胞内活性氧
• 2.6 流式细胞仪测定线粒体膜电位
• 2.7 Western-Blot检测蛋白表达
• 2.8 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 转MtFt质粒细胞的鉴定
• 3.2 细胞活力的测定
• 3.3 透射电镜下鱼藤酮对线粒体结构的影响
• 3.4 MtFt对鱼藤酮损伤后的SH-SY5Y细胞可变铁池（LIP）的影响
• 3.5 MtFt对鱼藤酮损伤后的SH-SY5Y细胞铁代谢相关蛋白Ferritin-L,TfR1,FPN1表达的影响
• 3.6 MtFt对鱼藤酮损伤后的SH-SY5Y细胞内活性氧（ROS）水平的影响
• 3.7 MtFt对鱼藤酮损伤后的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位（MMP）的影响
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历