论文摘要
原核生物、酵母、真菌、寄生虫、植物和藻类中的EPSP合成酶（EPSPs）是这些生物芳香族氨基酸合成过程的关键酶。作为莽草酸途径中的一个必需酶，EPSPs可逆地催化莽草酸-3-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸缩合成EPSP并产生无机磷。草甘膦与磷酸烯醇式丙酮酸的结构相似，可以竞争地与莽草酸羟基乙烯转移酶结合，特异性抑制EPSPs活性，是一种广谱灭生性除草剂。而且草甘膦在土壤中可以被降解为无毒成分，因而被认为是一种较为安全的优良除草剂。植物中EPSPs的过量表达或某些活性位点氨基酸的突变可导致其对高剂量的草甘膦的耐受性。为了提高农业生产效率，从细菌中分离的耐草甘膦EPSPs基因被克隆并转入多种农作物中，培育出抗除草剂转基因农作物并推广应用获得了很好的效果。生产实践中发现一种百合科葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性，其抗性来源极有可能是由于其EPSP合成酶的结构或表达独特性，使其与草甘膦的结合能力下降而产生的。这种自然发生的草甘膦抗性并不多见，可为农作物抗草甘膦的基因工程提供更安全的植物来源基因资源，很有必要加以深入研究。根据同源比较其它高等植物中EPSP合成酶基因，获得该基因的保守序列区并设计一对简并寡核甘酸引物。以薤白的总RNA为模板进行RT-PCR反应，克隆出了EPSPs基因0.5Kb的中心片段，然后通过RACE技术分别获得基因3′端包含多聚A尾的序列和5′端序列，最后获得了薤白EPSPs cDNA全序列。薤白EPSPsA cDNA全长为1821bp，可以翻译成一段包含522个氨基酸的推测蛋白质。经BLAST及蛋白质结构推测分析，证实我们得到的cDNA序列即是薤白EPSPs基因序列，将其命名为EPSPsA，并将此序列提交GenBank，登录号为：DQ462442。为了进一步了解EPSPsA基因在薤白组织中的表达情况，揭示薤白芳香族氨基酸合成及其基因表达调控机制，以薤白18S rRNA为内参基因，EPSPs基因3′非保守区域为检测目的基因，应用RT-PCR技术对薤白EPSPs基因的表达进行半定量分析，建立一个针对EPSPs的特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系。结果显示在薤白根、茎、老叶、嫩叶中都可检测到EPSPsA基因的表达，其表达水平为：嫩叶＞根＞茎＞老叶，相对表达量依次为：0.631，0.246，0.218，0.120。根据EPSPsA基因序列及原核表达载体pMAL-p2X载体多克隆位点序列，采用PCR的方法将EPSPsA基因构建到pMAL-p2X载体上获得融合表达载体pMAL-p2X-EPSPsA，并转入大肠杆菌TBl中表达，通过IPTG的诱导和SDS—PAGE的方法初步分析了表达产物，能诱导产生一条预计大小的蛋白诱导带；将表达EPSPsA的细菌接种于含草甘膦的培养基中，检测到细菌对草甘膦的抗性有所提高。利用大肠杆菌pREST-A表达系统，将除掉部分信号肽的薤白EPSPsA cDNA克隆表达，当转入大肠杆菌BL21（DE3）后，大肠杆菌对草甘膦的耐受性比pMAL-p2X-EPSPsA明显提高。推测可能是薤白EPSP合酶信号肽的存在，而不能在大肠杆菌中正确定位。将克隆的薤白EPSPsA cDNA正向插入到植物表达载体pWM101中，并置于35S启动子下游，构建成植物过表达薤白EPSPsA的重组基因。以根癌农杆菌介导法将过表达薤白EPSPsA的重组基因转入烟草“WS38”，先通过潮霉素抗性筛选获得了转基因的抗性愈伤组织，当愈伤组织培养3w后，将愈伤接种于含有草甘膦的培养基中，鉴定其草甘膦抗性。结果表明，对照烟草愈伤组织对草甘膦极为敏感，在50mg／L浓度时，2w内即全部坏死。而转基因烟草耐受浓度达到800mg／L。当浓度达到1200mg／L时，愈伤组织才在2w内逐步坏死。这进一步证实了薤白EPSPsA是一种抗草甘膦的酶，也从分子水平揭示了薤白抗草甘膦的机制。薤白EPSPsA基因有望运用于转基因抗除草剂的农作物基因工程。