论文摘要
水体富营养化是全球十大环境问题之一。氮磷尤其是磷的输入是引起水体富营养化的关键因素。城镇生活污水的排放是水体磷污染的主要来源之一。为解决磷污染所带来的危害，在污水进入水体前进行有效处理，降低排放污水的磷浓度十分必要。目前世界各地大规模污水处理厂主要采用强化生物除磷工艺（Enhanced biological phosphorus removal，EBPR），EBPR工艺具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。在EBPR系统中聚磷菌在磷的去除中起着至关重要的作用。为此，加大对聚磷菌的聚磷特性、聚磷相关基因及聚磷菌的工程化应用进行研究十分必要。本文以高效聚磷菌聚磷机理研究为主线，以高效聚磷菌GM6为研究材料，系统研究了高效聚磷菌的几个与聚磷相关的ppk基因、ppx基因、phoU基因和phaZ基因等。通过对这些基因进行克隆、表达和敲除失活来研究菌株在强化废水生物除磷工艺中的作用，取得了大量关于污水强化生物除磷菌基因调控过程的基础研究成果。一．Pseudomonas putida GM6的ppk基因的克隆和敲除以及除磷特性研究运用SEFA-PCR的方法，从GM6中扩增出多聚磷酸盐激酶基因（ppk），预测其全长为2220 bps，氨基酸水平比对发现与Pseudomonas putida KT2440的同源性为89％，Pseudomonas aeruginosa PAO1为80％，Acinetobacter sp．ADP1为58％，Escherichia coli K12-MG1655为33％。通过构建同源重组载体，经两次同源重组获得了失去中间约1 000bps的ppk-突变株。将突变株和原始菌株分别接入低磷培养基和合成废水中进行好氧培养。发现在同等初始OD值下，单位干重菌株所吸收的磷在重量上并无显著差异；而当初始OD值不相等时，OD值越大每毫克细胞干重所吸收的磷反而越少。用poly-P染色法对处于好氧培养状态的突变株和原始菌株分别染色，结果发现在同等的条件下，用染色方法无法观察到突变株菌体内有poly-P的存在，而却能在原始菌株中观察到。由于ppk基因参与催化合成长链多聚磷酸盐的，由第二个ppk基因（ppk2）来催化合成的短链多聚磷酸盐在胞内磷酸盐积累过程中可能也发挥着重要的作用。二．Pseudomonas putida GM6的ppx基因的克隆和敲除以及除磷特性研究根据克隆ppk基因的方法从GM6中克隆到它的下游基因序列多聚磷酸酯酶基因（ppx），该基因与ppk基因的转录方向相反。ppx长为1500 bps，编码500个氨基酸，以ATG作为起始密码子，UGA作为终止密码子。发现其氨基酸与Pseudomonas fluorescensPfO-1的同源性为88％，P．putida KT2440为84％，Pseudomonas syringae pv．syringaeB728a为83％。根据敲除ppk基因的方法设计两同源臂，最后获得失去中间约500 bps的ppx-突变株。将突变株和原始菌株分别接入低磷培养基和合成废水中进行好氧培养。结果发现，初始OD值相等时每毫克细胞干重所吸收的磷含量基本无差别，除磷效率并无明显差异，生长幅度也基本相同；但是，当初始OD值不相等时，每毫克细胞干重所吸收的磷含量与初始OD值的大小成反比。通过poly-P染色后发现，原始菌株和突变株均能观察到poly-P的存在，而用染色方法观察到的poly-P应该是长链的。我们从厌氧释磷实验中发现两种菌做成切片后也能在细胞中观察到较大的PHA颗粒，突变株中的颗粒少于原始菌株，且两菌株在单位时间内的释磷量和PHAs／MLSS值均成正比，但突变株的释磷量明显少于原始菌株，菌体合成的PHAs量占菌体干重的比例也低于原始菌株。这些结果表明，菌株GM6中可能还存在第二个ppx基因（ppx2），它同样能催化poly-P降解成正磷酸盐，而且ppx2可能是一个水解短链poly-P的功能性基因。三．GM6 phoU基因的克隆、KT2440 phoU基因的表达和敲除以及碱性磷酸酯酶的反应动力学特性研究根据ppk基因敲除方法，获得了KT2440的phoU-突变菌株。将突变株和原始菌株分别点接于低磷和高磷MOPS（X-Pi）的平板上，结果发现突变株在高磷平板上由原来的白斑变成了蓝斑。这表明菌株KT2440在失去phoU基因功能后，碱性磷酸酯酶能在高磷平板上表达了，这一结果证明了PhoU在磷转运系统中是一个负调控蛋白。通过测定原始菌株和突变株的生长值和碱性磷酸酯酶活力，发现突变株在LB培养基上的长势没有原始菌株好；根据磷酸苯二钠测定方法，突变株在这两种培养基上的酶活均高于原始菌株。然后从KT2440中扩增基因簇pstSCAB-phoU，构建表达载体，转入GM6中得到表达菌株。但表达菌株仍于高磷的MOPS（X-Pi）平板上显蓝斑，表明KT2440中的phoU甚至phoU-pstSCAB基因簇并不能抑制GM6中碱性磷酸酯酶的表达。根据已报道的假单胞菌属的phoU基因的保守序列从GM6中获得了磷转运调控系统的基因簇pstSCA-phoU片段序列，其中phoU基因与KT2440的此蛋白同源性为92％。四．Pseudomonas putida GM6的phaZ基因的克隆和敲除以及除磷特性研究从GM6中扩增出与PHA有关的基因簇（phaC1-phaZ-phaC2），其中phaC1和phaC2均是PHA合成酶基因，phaZ基因是PHA解聚酶基因。预测phaZ基因全长为852 bps，发现与P．putida的同源性为84％，Pseudomonas sp．PC17为87％，P．fluorescens PfO-1为88％。通过构建同源重组载体和同源臂的交换获得了GM6的phaZ-突变株D7。将突变株和原始菌株分别接种于LB和低磷培养基（10μM）中，结果发现突变株在这两种培养基中的生长值与原始菌株相比均减少了，且在低磷培养基中的减少幅度明显大于LB培养基。厌氧释磷实验发现两种菌做成切片在透射电子显微镜下观察能明显地看到细胞内的PHA颗粒，且突变株的PHA颗粒略多于原始菌株。通过测定培养液的上清液磷浓度，结果又发现两菌株在一直保持初始OD值的条件下，原始菌株GM6在单位时间内的释磷量均比突变株D7明显，且经过相同时间两菌株均到达最大释磷量。通过对菌体干重和菌体内的PHAs干重的测定，发现随着菌体释磷量的增大，两种菌菌体内的PHAs含量的比重逐渐增加，但单位时间内菌体合成的PHAs量占菌体干重的比例却不如D7高。GM6和D7在合成废水中的好氧生长试验表明两菌株的生长情况与在LB培养基中的非常相似，经过7h均到达稳定期，且突变株的长势略差于原始菌株。而随着时间的延长，突变株和原始菌株的每毫克细胞干重所吸收的磷量也逐渐增加，经过8h后基本趋于稳定，但原始菌株的最大吸磷量约为突变株的两倍。通过将培养了8h的菌体做成切片在透射电子显微镜下观察发现，两菌株均能合成poly-P颗粒，且原始菌株的每个细胞内的poly-P颗粒数多于突变株。