论文摘要
目的:观察金雀异黄素及U73122对骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）诱导分化为神经元样细胞前后Ca2+浓度及基因方面的变化及影响。以进一步研究骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的机制。方法:1.骨髓间充质干细胞的分离和培养:成年雄性SD大鼠,于无菌条件下取双侧股骨和胫骨,剪除骨两端,用5ml L-DMEM冲洗骨髓腔,将含有骨髓的冲洗液经Percoll分离液离心分离,计数细胞调整密度,按1×109/L接种于培养瓶中,50 mL/L（体积分数）二氧化碳,37℃温箱中培养。原代细胞传至第四代,待细胞融汇成致密单层后,细胞消化后传代,按照所用培养液不同将细胞分为四组:A组:单纯培养对照组;B组:加入酪氨酸激酶受体拮抗剂金雀异黄素（100umol/L）组;C组:加入磷脂酶C受体拮抗剂U73122（1umol/L）组;D组:联合加入酪氨酸激酶受体拮抗剂金雀异黄素（100umol/L）和磷脂酶C受体拮抗剂U73122（1umol/L）组,将MSCs放入CO2培养箱进行培养。倒置相差显微镜下观察原代、传代细胞的形态变化及生长状态。2.骨髓间充质干细胞的诱导分化:细胞传至第5代后按照Woodbury方案进行预诱导和诱导。加入L-DMEM+1mmol/Lβ-巯基乙醇+20%FBS预诱导24小时后,加入L-DMEM+5mmol/Lβ-巯基乙醇进行诱导5小时,并在倒置相差显微镜下进行观察、照相。3.神经细胞的鉴定:对诱导前后细胞进行免疫组织化学SP法检测,观察神经前体细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶（Neuron Specific Enolase, NSE）、胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）的表达,以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性,未着色为阴性。4.激光扫描共聚焦显微镜检测诱导前后细胞内游离钙离子浓度方法:细胞传至第四代,待细胞融汇成致密单层后,细胞消化后传至共聚焦专用培养皿中,按照所用培养液不同将细胞分为上述四组（每组8个）。A组及B、C、D组分别加药后24小时,用含有1mmol/L的β-巯基乙醇,20%胎牛血清的L-DMEM进行预诱导,24h后去除预诱导液,0.01M PBS （PH7.4）冲洗三次,加入含有10umol/LFluo-3/AM的L-DMEM培养液负载45min,每隔10分钟轻轻吹打,避光,45分钟后,0.01M PBS （PH7.4）冲洗三次,加入诱导液（L-DMEM、5mmol/Lβ-巯基乙醇）进行诱导培养,并在激光共聚焦显微镜下进行观察、照相。5.总RNA的提取和Realtime-PCR:参照Trizol试剂说明书提取各组诱导前后细胞的总RNA,测定提取总RNA的纯度,采用Realtime-PCR诱导前后细胞的GAP-43、NSE、NF、Nestin mRNA的表达水平,建立Excel数据表,应用SPSS13.0软件进行统计学处理。结果:1.各组MSCs贴壁生长情况良好,大部分细胞贴壁呈长梭形。传代后细胞形态和原代细胞相似,生长加快。2. MSCs经诱导后细胞形态变化明显,胞体收缩成锥形、球形,突起增多,表现出神经细胞样形态。诱导后5小时具有神经细胞形态特点的细胞数量逐渐增多,形成双极或多极细胞,而且细胞的多个突起发出分支,相互交织成网,此时形态也不再发生明显改变,具有典型的神经细胞样形态。3.四组诱导后细胞神经元标志物的免疫细胞化学检测显示:诱导后5小时,NSE和GFAP的表达均呈阳性,提示四组细胞在诱导后均转化为神经细胞。4.更换诱导液后, A组细胞内荧光强度逐渐增加,到100s达高峰值,其后逐渐减弱,但30min时细胞荧光强度仍高于诱导前,此时可见骨髓间充质干细胞开始向神经元样细胞分化。金雀异黄素及U-73122能够抑制细胞内Ca2+浓度升高。5. Realtime-PCR结果显示:各组细胞在诱导分化前后均表达GAP-43、NSE、NF、Nestin。四组细胞GAP-43、NSE、NF、Nestin在诱导分化前后的表达没有统计学意义。结论:1.骨髓间充质干细胞经诱导后,NSE、GFAP蛋白表达明显增高,细胞形态向神经元样细胞转变。说明β-巯基乙醇可诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化。2.骨髓间充质干细胞经β-巯基乙醇诱导后,细胞内Ca2+浓度升高。阻断NGF/TrkA/PLC-γ通路后,诱导后细胞内Ca2+浓度升高受到抑制。说明阻断该通路可抑制β-巯基乙醇诱导后细胞内Ca2+浓度的升高。但各组细胞诱导后NSE、GFAP蛋白表达明显增高,说明Ca2+在诱导过程中可能不起关键性作用。3.阻断NGF/TrkA/PLC-γ通路后,对β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化无影响,四组诱导后均表现为NSE、GFAP蛋白表达水平增高,说明NGF/TrkA信号传导途径可能不参与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化。4.各组细胞诱导后NSE、GFAP蛋白表达水平均有增高,但GAP-43、NSE、NF、Nestin基因表达改变不显著,说明β-巯基乙醇诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化可能为转录后水平即蛋白水平的调控。
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