胶原性关节炎大鼠CD4+CD25+调节性T细胞对腹腔巨噬细胞的调控机制及来氟米特的作用

论文摘要

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性、全身性、自身免疫性疾病,其病因及发病机制目前仍不清楚。近年来,人们发现CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+ regulatory T cells, CD4+CD25+Tregs）是一群具有独特作用方式和功能特征的T细胞亚群,具有免疫调节作用。其在RA中的作用受到人们的广泛关注,有望成为治疗RA和筛选抗RA药物的靶点之一。大量研究表明,CD4+CD25+Tregs能够抑制自身反应性T细胞的活化与效应功能,以“主动”方式维持免疫耐受和自身稳定。越来越多的证据表明,RA患者体内CD4+CD25+Tregs存在异常,CD4+CD25+Tregs的数量和/或功能不足可能与RA的发生、发展有关。CD4+CD25+Tregs在自身免疫性疾病中的表达已成为目前研究的热点,但有关CD4+CD25+Tregs在RA中的表达与作用机制尚不明确,值得进一步深入研究。因此,本课题选用大鼠胶原性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）这种国际公认的RA动物模型,在成功提取纯化CⅡ、建立大鼠CIA模型的基础上,动态监测外周血中CD4+CD25+Tregs的比例变化,分析其在关节炎病程中的作用。并且以CD4+CD25+Tregs的主要细胞因子TGF-β1为切入点,探讨CD4+CD25+Tregs对腹腔巨噬细胞的调控机制及抗关节炎药来氟米特的作用,为研究RA的发病机制和治疗提供新的理论依据。研究内容主要包括以下三个部分:1.提取和纯化鸡Ⅱ型胶原,建立大鼠胶原性关节炎模型采用酸性条件下蛋白酶解与中性条件下层析洗脱的双重方法,成功获得乙酸可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白（Collagen TypeⅡ, CⅡ）,得率约为0.17%。经SDS-PAGE和全波长紫外扫描检测,确定其与Sigma公司CⅡ标准品一致。采用CⅡ建立大鼠胶原性关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）模型,从体重、足爪肿胀度、多发性关节炎评分、血清中抗CⅡ抗体浓度、病理等几个方面评价,确定模型制备成功。经4次反复实验,造模成功率约为42%。2.研究CIA大鼠CD4+CD25+调节性T细胞对腹腔巨噬细胞的调控机制动态监测大鼠CIA病变过程中外周血CD4+CD25+Foxp3+T细胞的比例,与足爪肿胀做相关性分析。结果表明:CIA大鼠足爪肿胀与CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Tregs）的比例呈负相关,相关系数为-0.786。免疫荧光和RT-PCR结果显示,CIA大鼠CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+Tregs）和腹腔巨噬细胞（Peritoneal macrophage,PMΦ）上分别表达TGF-β和TGF-βRII（Tβ-RII）,说明TGF-β是CD4+CD25+Tregs的重要细胞因子,CD4+CD25+Tregs可通过TGF-β对巨噬细胞（macrophage, MΦ）起作用,与文献报道的结果相一致。采用TGF-β与CIA大鼠PMΦ体外共培养,研究TGF-β对CIA大鼠PMΦ免疫功能的影响及作用机制。结果表明:TGF-β（5ng/ml, 36h）可抑制LPS刺激的CIA大鼠PMΦ炎性细胞因子TNF-α和IL-6的分泌及mRNA的表达;促进抑炎性细胞因子IL-10的分泌和mRNA的表达;抑制NO的分泌及iNOSmRNA的表达。RT-PCR、流式细胞术及Western blot结果表明,TGF-β（5ng/ml, 36h）可抑制LPS刺激的CIA大鼠PMΦTLR4 mRNA和蛋白的表达,以上结果表明TGF-β可通过LPS-TLR4通路影响CIA大鼠PMΦ的免疫功能。3.探讨来氟米特对CIA大鼠CD4+CD25+调节性T细胞调控腹腔巨噬细胞的影响首先,来氟米特可以直接对CIA大鼠CD4+CD25+Tregs产生影响。体内实验结果表明,来氟米特（Lef 2 mg/kg,d12-d33）对CIA大鼠具有治疗作用,可升高CIA大鼠脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs的比例及Foxp3 mRNA的表达。体外ConA诱导的CIA大鼠脾淋巴细胞增殖体系中,A771726（0.1、1、10μM）可促进脾淋巴细胞向CD4+CD25+Tregs分化,增加TGF-β的分泌,从而抑制ConA介导的脾淋巴细胞增殖活性。其次,来氟米特可以直接抑制CIA大鼠腹腔巨噬细胞的功能。体外实验结果表明,A771726（0.1、1、10μM）通过LPS-TLR4通路抑制CIA大鼠PMΦ的分泌功能。第三,来氟米特可以加强CD4+CD25+Tregs对PMΦ的调控作用。具体表现为:体外实验中,A771726（0.1、1、10μM）可加强TGF-β对CIA大鼠PMΦ分泌炎性细胞因子的抑制作用、促进抑炎性细胞因子的分泌;加强TGF-β对PMΦ产生NO的抑制作用。RT-PCR及Western blot结果表明,A771726可通过进一步抑制CIA大鼠PMΦTLR4的表达,从而加强TGF-β对PMΦ的调控作用。结论:①制备CⅡ建立大鼠CIA模型,在临床表现、免疫学和组织病理学方面均与人类RA类似,提示模型制备成功。②CIA大鼠CD4+CD25+Tregs对PMΦ的调控机制:CD4+CD25+Tregs可通过TGF-β与PMΦ上的Tβ-RII结合,抑制PMΦ表面TLR4的表达,从而抑制LPS刺激的CIA大鼠PMΦ的免疫功能。③来氟米特对CIA大鼠具有治疗作用,其机制可能有三:提高CIA大鼠抑制性细胞CD4+CD25+Tregs的比例;直接抑制PMΦ的免疫功能;通过LPS-TLR4途径加强CD4+CD25+Tregs对PMΦ的调控作用。

论文目录

• 中英文缩写词对照
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• 1 前言
• 2 实验材料
• 2.1 动物
• 2.2 药品和试剂
• 2.3 仪器与设备
• 3 实验方法
• 3.1 乙酸可溶性鸡Ⅱ型胶原的提取、纯化和鉴定
• 3.1.1 鸡软骨的处理
• 3.1.2 溶解、提纯鸡Ⅱ型胶原（CⅡ）
• 3.1.3 CⅡ的鉴定
• 3.2 大鼠胶原性关节炎模型的建立及评价
• 3.2.1 乳剂的制备
• 3.2.2 大鼠 C I A 模型的建立
• 3.2.3 大鼠 C I A 模型的评价
• 3.3 分组及给药方法
• 3.3.1 体内实验
• 3.3.2 体外实验
• 3.4 脾 T 淋巴细胞的增殖反应
• 3.5 放射免疫法
• 3.6 ELISA 法
• 3.7 一氧化氮（NO）的含量测定
• 3.8 免疫荧光
• 3.8.1 CD 6 8 分子鉴定巨噬细胞
• 3.8.2 双染 CD25 和 TGF-β
• 3.9 流式细胞术检测 TLR4
• +CD25⁺Foxp3⁺Tregs 的比例'>3.10 流式细胞仪检测 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Tregs 的比例
• 3.11 RT-PCR 检测mRNA 的表达
• 3.12 免疫印记（western blot）检测蛋白表达
• 3.13 统计学分析
• 4 实验结果
• 4.1 Ⅱ型胶原的鉴定及大鼠胶原性关节炎模型的建立
• 4.1.1 CⅡ的鉴定
• 4.1.2 CIA 大鼠的体症
• 4.1.3 大鼠 CIA 模型的评价
• 4.1.4 大鼠 CIA 的造模成功率
• +CD25⁺调节性T 细胞对腹腔巨噬细胞的调控机制研究'>4.2 CIA 大鼠CD4⁺CD25⁺调节性T 细胞对腹腔巨噬细胞的调控机制研究
• +CD25⁺Tregs 比例的动态变化'>4.2.1 CIA 大鼠外周血CD4+T 细胞中CD4⁺CD25⁺Tregs 比例的动态变化
• +CD25⁺Tregs 通过 TGF-β对腹腔巨噬细胞起作用'>4.2.2 CD4⁺CD25⁺Tregs 通过 TGF-β对腹腔巨噬细胞起作用
• 4.2.3 TGF-β对 CIA 大鼠 PMΦ的调控机制研究
• +CD25⁺调节性 T 细胞的影响'>4.3 来氟米特对 CIA 大鼠 CD4⁺CD25⁺调节性 T 细胞的影响
• 4.3.1 Le f 对 CI A 大鼠的治疗作用
• +CD25⁺Tregs 的影响'>4.3.2 Lef 对 CIA 大鼠脾脏中 CD4⁺CD25⁺Tregs 的影响
• 4.4 来氟米特对 CIA 大鼠腹腔巨噬细胞的影响
• 4.4.1 in vitro A771726 对LPS 刺激的CIA 大鼠PMΦ分泌功能的影响
• 4.4.2 in vitro A771726 对LPS 刺激的CIA 大鼠PMΦ产生NO 的影响
• 4.4.3 in vitro A771726 对LPS 刺激的CIA 大鼠PMΦ上TLR4 的影响
• 4.5 来氟米特对 TGF-β调控 CIA 大鼠腹腔巨噬细胞的影响
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 参考文献
• 附件 硕士期间工作总结