西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因5’侧序列克隆和分析及乳腺特异性表达载体的构建

论文摘要

乳腺生物反应器（Mammary G1and Bioreactor,MGB）是一种高效率蛋白质合成器官,它可以利用转基因动物的乳腺组织生产基因工程药用蛋白。采用基因工程技术在动物乳腺生产有药用价值的蛋白质和多肽,具有产量高、成本低和产品质量好等优点。目前常用的转基因动物有猪、羊、牛,它们的泌乳量大,活性蛋白的产量高,且乳液容易收集。因此,转基因动物乳腺生物反应器就像一座生产活性蛋白的药物工厂,能够源源不断地生产出人类所需的药用蛋白。本研究采用PCR 技术从西农萨能奶山羊基因组中扩增出?-酪蛋白基因5’侧序列。将该序列克隆入pMD18-T 载体,并对其进行序列测定,表明克隆得到西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因-4359-+2106bp 区,共6,465 bp 的序列。生物信息学分析显示:该序列与已公布的其它山羊β-酪蛋白基因序列具有极高同源性（96%98%）,包含有TATA启动子序列和HOXF、Oct-1、AP1、CEBP、STAT、NFKB、GR、ER、PR、ETS 等转录因子识别位点,该序列保留了β-酪蛋白第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分。将此6,465 bp 片段插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic 中,构建载体pGL3/B65。瞬时转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,48 h 后检测显示,该5’侧序列具有启动子和增强子活性,对促乳素发生应答。随后将?-酪蛋白基因5’侧序列克隆到pcDNA3.1（-）中,构建了乳腺特异性表达载体pcDNA3.1-65。又将hBMP2 的cDNA,克隆到pcDNA3.1-65 中,构建了hBMP2 乳腺表达载体pcDNA3.1-65-hBMP2,转染原代培养的西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,促乳素诱导48h 后,hBMP2 的免疫细胞化学染色呈阳性反应,荧光颗粒主要见于细胞浆内,呈弥漫及团状分布,胞核淡染,对照组的胞浆内染色颗粒消失或较弱。Western blotting显示,已转染pcDNA3.1-65-hBMP2 载体并经促乳素诱导的乳腺上皮细胞裂解液中hBMP2 蛋白条带明显存在,未经促乳素诱导则hBMP2 蛋白带明显减弱;而转染pcDNA3.1（-）、pcDNA3.1-65 载体的细胞在同样位置未见蛋白条带。相关研究结果如下: 1.克隆了西农萨能奶山羊?-酪蛋白基因5’侧序列,共6,465bp 的片段, 所测序列已登录GenBank,GenBank Accession No. AY834229。用启动子和增强子捕获实验检测,证明所克隆的6,465bp 的序列具有启动子和增强子元件。2.利用该5’侧序列构建了乳腺特异性表达载体pcDNA3.1-65,并将hBMP2的cDNA片断克隆入该载体,初步用西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞检测,证明该载体能受促乳素诱导而表达hBMP2,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。

论文目录

• 文献综述
• 第一章 动物乳腺生物反应器的研究进展
• 1 动物乳腺生物反应器表达载体的构建
• 1.1 启动子调控元件
• 1.2 与乳腺组织特异性表达有关的调控元件
• 1.3 内含子对基因表达的影响
• 1.4 具有染色体变构和开放功能的元件
• 1.5 与转录翻译有关的元件
• 2 目的基因的选择
• 3 乳腺特异性表达载体有效性的检测系统
• 3.1 离体组织培养细胞法
• 3.2 体外泌乳系统法
• 3.3 DNA 直接注射法
• 3.4 脂质体包埋法
• 3.5 逆转录病毒介导法
• 4 转基因动物实验的常用方法
• 4.1 受精卵原核显微注射
• 4.2 精子转导法
• 4.3 胚胎逆转录病毒感染法
• 4.4 胚胎干细胞介导法
• 4.5 体细胞核移植法
• 4.6 基因打靶技术
• 5 动物乳腺生物反应器面临的机遇和挑战
• 实验研究
• 第二章 西农萨能奶山羊Β-酪蛋白5′侧序列克隆和分析及乳腺特异性表达载体的构建和测试
• 1 西农萨能奶山羊β-酪蛋白5′侧序列的克隆及其生物信息学分析
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 2 西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因5′侧序列调控荧光素酶报告基因载体的构建及在山羊乳腺上皮细胞中的表达
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 结果
• 3 含西农萨能奶山羊?-酪蛋白基因5′侧序列表达载体的构建及其表达活性分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历和攻读学位期间的研究成果