猪2型圆环病毒ORF1、ORF2基因的克隆表达

论文摘要

猪2 型圆环病毒（porcine　circovirus　2,PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning　multisystemic　wasting　syndrome,　PMWS）的病原,它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡,还与仔猪A2型先天性震颤（congential　tremor　type　A　II,CT）、怀孕母猪流产（reproductive　failure）　、成年猪皮炎肾炎综合征（porcine　dermatitis　and　nephropathy,PDNS）和呼吸道疾病综合征（porcine　respiratory　disease　syndrome,　PRDS）有关。这些疾病的广泛流行严重影响养猪业,给好多国家和地区带来巨大的损失,更为严重的是PCV2 的感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,造成的间接损失难以估计。PCV2 已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。目前,对于PCV2感染的防制没有有效的方法和疫苗,其原因在于PCV2 对细胞感染率极低,也不出现细胞病变（CPE）,另外PCV2 是哺乳动物病毒中最小的病毒之一,该病毒的纯化、浓缩难度很大,不能走传统的制造灭活疫苗等控制方法的道路。本实验希望通过分子生物学手段获得对本病毒感染行之有效的检测试剂和基因工程疫苗,为综合防制该病提供理论依据。　本论文的实验由两部分构成,一是从含有PCV2 的PK-15 细胞中克隆出PCV2 的ORF2基因,利用大肠杆菌原核表达系统,通过基因重组技术表达出ORF2基因,二是从含有PCV2的PK-15 细胞中克隆出PCV2 的ORF1、构建含有ORF1 的重组腺病毒,并在293 细胞中获得表达。主要结果如下:　1.以PCV2　的PK-15 细胞毒为材料,参照已发表的PCV2 基因组序列,设计1 对引物,应用PCR 扩增PCV2 广东株ORF2 基因的后部约600bp 片断。该PCV2-ORF2 基因已去除终止子,并在其上下游添加Kpn　I 和Hind　III 酶切位点。PCR 产物用Kpn I 和Hind　III 酶切后与经同样处理过的pBAD/gIII B　Vector 连接,转化TOP10 细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose 进行诱导,　SDS-PAGE 和Western　blot 分析,表明ORF2 基因确实在大肠杆菌中得到了表达,表达的多肽为28Ku。　　2.根据PCV2　ORF1 基因的序列设计两条引物从PCV2 的PK15 细胞培养物中扩增出ORF1 基因（945bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T 载体,经酶切、测序鉴定筛选出重组质粒pMD-ORF1。将PCV2　ORF1 基因克隆入pAdeasy 腺病毒载体系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV 中,获得重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-ORF1,将重组质粒与腺病毒骨架载体共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF1,然后用PacⅠ线性化后转染293 细胞,在293 细胞内包装出重组腺病毒。通过荧光显微镜观察、PCR 检测和Western　blot 检测,证明PCV2　ORF1 基因在293 细胞内获得表达,且

论文目录

• 文献综述
• 第一章 猪圆环病毒的研究进展
• 1.1 猪圆环病毒的研究进展
• 1.1.1 猪圆环病毒的发现和命名
• 1.1.2 猪圆环病毒的病毒学分类地位
• 1.1.3 猪圆环病毒的全球流行状况和分布
• 1.1.4 猪圆环病毒的形态学特性
• 1.1.5 猪圆环病毒的理化特性
• 1.1.6 猪圆环病毒的基因组
• 1.1.7 猪圆环病毒的复制与转录
• 1.1.8 猪圆环病毒编码蛋白的研究
• 1.1.9 猪圆环病毒Ⅱ型的致病机理
• 1.1.10 组织病理学研究
• 1.1.11 猪圆环病毒Ⅱ型的诊断
• 1.1.11.1 病毒分离
• 1.1.11.2 间接免疫荧光试验
• 1.1.11.3 聚合酶链反应
• 1.1.11.4 酶联免疫吸附试验
• 1.1.11.5 原位核酸杂交试验
• 1.1.12 猪圆环病毒Ⅱ型感染的防制
• 1.2 论文设计思路及技术路线
• 第二章 大肠杆菌与腺病毒表达系统概况
• 2.1 大肠杆菌表达外源蛋白研究进展
• 2.1.1 大肠杆菌表达外源蛋白的优缺点
• 2.1.2 大肠杆菌表达外源蛋白的特性及存在形式
• 2.1.3 影响大肠杆菌表达系统表达外源蛋白的因素
• 2.2 腺病毒表达系统
• 2.2.1 腺病毒的基本结构
• 2.2.2 腺病毒的感染机制
• 2.2.3 腺病毒作为载体的发展
• 2.2.4 腺病毒载体系统AdEasy是新型高效的目的基因转移系统
• 2.2.5 应用腺病毒表达系统表达外源基因的优点
• 2.2.6 腺病毒基因工程疫苗的特性
• 2.2.7 在AdEasy腺病毒载体系统操作过程需注意一些问题
• 2.2.8 腺病毒载体的发展前景
• 实验研究
• 第三章 2 型圆环病毒ORF2 基因在大肠杆菌中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种及质粒
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要药品及试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 目的片断的扩增、纯化与回收
• 3.2.1.1 PCV2 的DNA 提取
• 3.2.1.2 引物设计
• 3.2.1.3 PCR 扩增ORF2 基因
• 3.2.1.4 PCR 产物回收
• 3.2.2 目的基因的克隆
• 3.2.2.1 PCR 产物与pMD18-T 载体的连接
• 3.2.2.2 感受态细胞的制备
• 3.2.2.3 连接产物的转化
• 3.2.3 重组质粒的提取与鉴定
• 3.2.3.1 小量提取质粒
• 3.2.3.2 重组质粒鉴定
• 3.2.4 ORF2 基因原核表达载体的构建
• 3.2.4.1 引物设计
• 3.2.4.2 PCR 扩增ORF2 基因
• 3.2.4.3 含ORF2 基因的原核表达载体构建
• 3.2.5 重组融合蛋白pBAD/gⅢ-ORF2-的诱导表达及检测
• 3.2.5.1 重组质粒在大肠杆菌中的表达
• 3.2.5.2 表达蛋白的检测
• 3.2.5.2.1 SDS-PAGE 电泳
• 3.2.5.2.2 Western blot 分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 PCR 扩增ORF2 基因电泳结果
• 3.3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3.3 PCR 扩增ORF2 基因
• 3.3.4 重组质粒pBAD/gⅢ-ORF2-的酶切和PCR 鉴定
• 3.3.5 ORF2-表达产物的SDS-PAGE 检测和Western blot 分析
• 3.4 讨论
• 第四章 圆环病毒2 型GD 株ORF1 基因重组腺病毒的构建及其表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 质粒、菌种及细胞株
• 4.1.2 工具酶及试剂
• 4.1.3 仪器与设备
• 4.1.4 DNA 操作中其他相关主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 pAdeasy-1、pAdTrack-CMV 的转化、扩增及目的质粒提取
• 4.2.2 引物设计、合成与目的基因的获得
• 4.2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建与鉴定
• 4.2.3.1 用于模板的PCV2 基因组DNA 制备
• 4.2.3.2 PCR 反应扩增ORF1 基因
• 4.2.3.3 纯化回收DNA 片段
• 4.2.3.4 纯化的PCR 产物及pAdTrack-CMV 酶切处理
• 4.2.3.5 连接反应
• 2） 法'>4.2.3.6 DH5a 感受态细胞的制备（CaCl₂） 法
• 4.2.3.7 连接产物的转化
• 4.2.3.8 重组质粒的提取
• 4.2.3.9 重组质粒的鉴定
• 4.2.3.9.1 重组质粒的PCR 鉴定
• 4.2.3.9.2 重组质粒的酶切鉴定
• 4.2.3.9.3 重组质粒的测序分析
• 4.3 pAdEasy-1 和pAdTrack-CMV-ORF1 同源重组
• 4.3.1 pAdEasier 的制备
• 4.3.1.1 BJ5183 感受态菌制备
• 4.3.1.2 pAdEasy-1 转化入BJ5183
• 4.3.1.3 从BJ5183 宿主菌中抽提质粒pAdEasy-1
• 4.3.1.4 酶切鉴定pAdEasy-1 的完整性
• 4.3.2 pAdEasier 感受态的制备
• 4.3.3 穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF1 线性化及纯化
• 4.3.3.1 pAdTrack-CMV-ORF1 线性化
• 4.3.3.2 线性化的pAdTrack-CMV-ORF1 的纯化
• 4.3.4 线性化pAdTrack-CMV-ORF1 转化感受态pAdEasier 进行同源重组
• 4.3.5 同源重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF1 的电泳及PCR 鉴定
• 4.3.6 酶切鉴定pAdCMV-ORF1
• 4.3.6.1 DH5a 感受态细胞的的制备
• 4.3.6.2 pAdCMV-ORF1 转化DH5a
• 4.3.6.3 从DH5a 宿主菌中抽提质粒pAdCMV-ORF1
• 4.3.6.4 酶切鉴定pAdCMV-ORF1
• 4.4 重组腺病毒AdCMV-ORF1 的制备
• 4.4.1 293 细胞的复苏和培养
• 4.4.2 重组腺病毒AdCMV-ORF1 的包装
• TM2000 介导pAdCMV-ORF1 和pAdEasy-1 转染293 细胞'>4.4.2.1 Lipofectamine^TM2000 介导pAdCMV-ORF1 和pAdEasy-1 转染293 细胞
• 4.4.3 重组腺病毒AdCMV-ORF1 的PCR 鉴定
• 4.4.3.1 重组腺病毒DNA 的制备
• 4.4.3.2 以AdCMV-ORF1 扩增ORF1 基因
• 4.4.4 重组腺病毒载体表达产物的SDS-PAGE 分析
• 4.4.5 重组腺病毒载体表达产物的Western Blot 鉴定
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 ORF1 基因的PCR 扩增
• 4.5.2 ORF1 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF1 的构建及鉴定
• 4.5.2.1 ORF1 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF1 的酶切鉴定
• 4.5.2.2 ORF1 重组穿梭载体pAdTrack-CMV-ORF1 的测序鉴定
• 4.5.3 同源重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF1 的构建及鉴定
• 4.5.3.1 ORF1 重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF1 的PCR 鉴定
• 4.5.3.2 重组腺病毒质粒pAdCMV-ORF1 的酶切鉴定
• 4.5.4 重组腺病毒AdCMV-ORF1 及其表达产物的鉴定
• 4.5.4.1 脂质体转染293 细胞的病变观察
• 4.5.4.2 表达PCV2 ORF1 的AdCMV-ORF1 荧光检测
• 4.5.4.3 重组腺病毒AdCMV-ORF1 的PCR 鉴定
• 4.5.5 AdCMV-ORF1 表达ORF1 的SDS-PAGE、Western Blot 鉴定
• 4.6 讨论
• 实验小结
• 致谢
• 参考文献
• 附录 1
• 附录 2
• 附录 3
• 附录 4
• 作者简介