重组海参溶菌酶工程菌发酵及表达产物纯化的研究

论文摘要

溶菌酶（lysozyme）是一种水解粘多糖的碱性酶蛋白,它催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酞氨基葡萄糖和N-乙酞胞壁酸之间糖苷键的水解,导致细菌细胞的壁破裂、内容物的逸出,使细菌死亡。溶菌酶是生物机体先天免疫系统中重组成部分之一,参与机体的多种免疫反应活动,改善和增强巨噬细胞的吞噬能力和消化功能,在溶菌过程中形成水解体系,破坏和消除侵入体内的异物,从而达到机体免疫防御的作用。溶菌酶本身是-种安全性能高的蛋白质,在医药、食品、生物领域中得到了广泛的应用。商品溶菌酶多从蛋清中提取,仅对革兰氏阳性菌有作用,限制了其应用范围,近年来国内外对多种来源的溶菌酶进行了广泛的研究,但有关海洋生物溶菌酶的研究报道较少。大肠杆菌具有生长快、遗传性状了解透彻、培养经济、待选质粒和宿主多、表达水平高等特点。虽然外源蛋白获得高水平的表达,但同时容易形成不可溶的包涵体,或者被宿主蛋白酶降解。目前国内外对蛋白质体外复性的研究较多,但其过程往往费时、费力、且不经济。因此,探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术研究价值和广泛的应用前景。主要的研究方法有宿主的选择、载体的选择及培养条件与诱导方法的选择等。本文主要研究重组海参i型溶菌酶（Stichopus japonicus lysozyme, SjLys）可溶性表达的发酵条件、纯化及生物学性质。采用摇瓶发酵的培养方式,分别从培养基组分和诱导方法两个方面对获得可溶性重组SjLys进行研究。实验结果显示,当培养基为LB/Amp,接种量为2%,填装量为20%,诱导温度为25℃,诱导剂IPTG浓度为1.Ommol/L,山梨醇浓度为0.4mol/L,甜菜碱浓度为2.5mmol/L时,成功获得可溶性重组SjLys蛋白。表达产物通过亲和层析、凝胶过滤层析、超滤等进行纯化方法,获得电泳纯为95%的重组SjLys蛋白。采用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,浊度法测定重组SjLys酶活力,并进一步对其生物学活性分析,结果表明该酶最适温度为45℃,最适pH值为6.8,当pH和温度分别在5.0～7.0、40℃以下时,其相对酶活可达到70%。最后,采用叠管法进行试验,结果表明重组溶菌酶抑菌谱较为广泛,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑菌作用,尤其对副溶血弧菌有明显的抑菌作用。上述结果将为海参溶菌酶进行产业化奠定应用基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 溶菌酶的研究进展
• 1.1.1 溶菌酶的定义
• 1.1.2 溶菌酶的结构、理化性质
• 1.1.3 溶菌酶的主要分类
• 1.1.4 溶菌酶的抗菌作用机理
• 1.1.5 溶菌酶的应用
• 1.1.5.1 溶菌酶在医疗行业中的应用
• 1.1.5.2 溶菌酶在食品行业的应用
• 1.1.5.3 溶菌酶在畜牧饲料行业中的应用
• 1.1.5.4 溶菌酶在科学研究中的应用
• 1.1.6 溶菌酶基因工程的研究
• 1.2 重组蛋白表达系统的研究进展
• 1.2.1 原核表达系统
• 1.2.1.1 大肠杆菌表达系统
• 1.2.1.2 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.2.2 真核表达系统
• 1.2.2.1 酵母表达系统
• 1.2.2.2 昆虫表达系统
• 1.2.2.3 哺乳动物细胞表达系统
• 1.2.2.4 植物表达系统
• 1.3 大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达
• 1.3.1 宿主细胞的选择
• 1.3.1.1 选择可溶性表达外源蛋白的宿主
• 1.3.1.2 外源蛋白与其他辅助蛋白共表达
• 1.3.2 载体选择
• 1.3.2.1 融合蛋白的构建
• 1.3.2.2 启动子的选择
• 1.3.2.3 分泌表达
• 1.3.3 培养条件与诱导方法的选择
• 1.3.3.1 培养基的组成
• 1.3.3.2 诱导条件
• 1.4 蛋白的分离纯化方法
• 1.4.1 固定金属亲和层析法
• 1.4.2 超滤法
• 1.4.3 离子交换层析法
• 1.4.4 凝胶过滤层析
• 1.5 研究的主要内容
• 1.6 研究的目的及意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 重组溶菌酶基因工程菌株的活化与保存
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.1.1 菌种
• 2.1.1.2 主要试剂
• 2.1.1.3 培养基
• 2.1.1.4 常用溶液及缓冲液
• 2.1.1.5 主要实验仪器
• 2.1.1.6 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 菌种划线培养
• 2.1.2.2 菌种液体培养
• 2.1.2.3 菌种斜面保藏
• 2.1.2.4 种子液培养
• 2.1.2.5 扩大培养
• 2.1.2.6 诱导培养
• 2.2 重组质粒的鉴定
• 2.2.1 材料与试剂
• 2.2.1.1 菌种
• 2.2.1.2 酶和试剂
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 常用溶液及缓冲液
• 2.2.1.5 主要仪器设备
• 2.2.2 方法与步骤
• 2.2.2.1 质粒提取
• 2.3 重组溶菌酶基因工程菌发酵条件的研究
• 2.3.1 材料与试剂
• 2.3.1.1 菌种
• 2.3.1.2 主要试剂
• 2.3.1.3 培养基
• 2.3.1.4 常用溶液及缓冲液
• 2.3.1.5 主要仪器设备
• 2.3.2 方法与步骤
• 2.3.2.1 菌体浓度的研究
• 2.3.2.2 培养基的研究
• 2.3.2.3 接种量研究
• 2.3.2.4 填装量的研究
• 2.4 重组溶菌酶蛋白可溶性表达条件的研究
• 2.4.1 材料与试剂
• 2.4.1.1 菌种
• 2.4.1.2 主要试剂
• 2.4.1.3 培养基
• 2.4.1.4 常用溶液及缓冲液
• 2.4.1.5 主要仪器设备
• 2.4.2 方法与步骤
• 2.4.2.1 细胞破碎及蛋白质浓度测定方法
• 2.4.2.2 诱导时间的研究
• 2.4.2.3 诱导剂浓度的研究
• 2.4.2.4 诱导温度的研究
• 2.4.2.5 山梨醇和甜菜碱对表达目的蛋白的研究
• 2.5 重组溶菌酶蛋白提取方法的研究
• 2.5.1 材料与试剂
• 2.5.1.1 主要材料
• 2.5.1.2 常用溶液及缓冲液
• 2.5.1.4 主要仪器设备
• 2.5.2 方法与步骤
• 2.5.2.1 亲和层析法提取目的蛋白的研究
• 2.5.2.2 超滤法提取目的蛋白的研究
• 2.5.2.3 脱盐的研究
• 2.6 重组溶菌酶生物学活性的研究
• 2.6.1 材料与试剂
• 2.6.1.1 材料
• 2.6.1.2 主要材料
• 2.6.1.3 常用缓冲液及培养基
• 2.6.1.4 主要仪器设备
• 2.6.2 方法与步骤
• 2.6.2.1 重组SjLys蛋白的酶活力测定
• 2.6.2.2 重组SjLys蛋白部分生物学性质研究
• 2.6.2.3 生物活性的测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 菌株的筛选
• 3.2 重组质粒鉴定
• 3.3 重组溶菌酶基因工程菌发酵条件分析
• 3.3.1 菌体浓度的研究
• 3.3.2 LB/Amp与TB/Amp培养基对表达量的影响
• 3.3.3 接种量对菌体生长的影响
• 3.3.4 填装量及摇瓶转速对菌体生长的影响
• 3.4 重组溶菌酶蛋白可溶性表达条件分析
• 3.4.1 蛋白含量的测定
• 3.4.2 诱导时间的研究
• 3.4.3 诱导剂浓度的研究
• 3.4.4 诱导温度的研究
• 3.4.5 山梨醇和甜菜碱对重组SjLys蛋白表达的影响
• 3.5 重组溶菌酶蛋白纯化方法分析
• 3.6 重组溶菌酶的生物学活性分析
• 3.6.1 最适温度和最适pH的测定
• 3.6.2 pH稳定性和热稳定性的测定
• 3.6.3 重组SjLys蛋白抑菌谱检测
• 第四章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 缩略词