论文摘要
Survivin基因是抗凋亡IAP（inhibitor of apoptosis）基因家族的新成员,在大多数人类肿瘤组织中表达水平异常增高,但是在正常的成人组织中表达水平很低。survivin表达的激活参与了肝癌的发病,以往的研究表明抑制survivin的表达可以破坏有丝分裂进程并促进细胞凋亡。因此,这种肿瘤表达特异性以及促有丝分裂的功能使得Survivin基因成为了肿瘤基因治疗研究的一个新靶点。为了降低Survivin基因的表达水平,我们特异性地针对survivin mRNA暴露区设计了四个核酶并克隆至pGVal载体:R1（+61）,R2（+83）,R3（+232）andR4（+358）,在证实其体外切割活性和效率后,装入非复制性腺病毒载体产生活性核酶分子,通过体内和体外的细胞增殖、凋亡和肿瘤生长等实验证实感染腺病毒-核酶的肝癌细胞中survivin的聚集受到显著抑制尤以R3为最。R1、R3和R4三联体核酶较之任何一个单体核酶能够更为有效地抑制survivin的表达。此外,通过检测PARP的水解反应可见核酶介导的survivin表达的抑制可以促进肝癌细胞的凋亡。在肝癌细胞移植瘤模型中,核酶的表达可以抑制肿瘤的生成。我们的实验结果显示针对survivin的核酶可以诱发凋亡并抑制肝癌的生长,本研究为进一步探索Survivin基因在细胞分裂中的作用机制提供了特异性的分子工具,同时也为肝癌的基因治疗提供了一种新的有效的手段。溶瘤病毒,即肿瘤细胞特异性增殖病毒,是一类极具前景的抗肿瘤基因治疗手段,它不仅能够选择性的在肿瘤细胞中增殖进而裂解、杀伤肿瘤细胞并释放出新的病毒继续感染其他肿瘤细胞,直至消灭全部肿瘤细胞,而且该方法同现有的治疗手段无交叉耐药作用。如何提高溶瘤病毒的肿瘤特异性是这一方法实现临床应用的关键所在。利用肿瘤特异性启动子来调控腺病毒增殖所必需的基因是提高溶瘤病毒的肿瘤特异性的主要方法之一。由天然的肿瘤特异性启动子来控制腺病毒复制必需基因表达的方法已被广泛研究,然而其强度和特异性却并不令人满意。在本实验中,我们设计并系统性地验证了一个新的策略,通过对在肿瘤血管内皮细胞中高表达的基因启动子区域的生物信息学分析,找到了6个出现频率最高的转录调控序列。继而将这6个转录调控序列随机组合,构建报告基因检测系统,在检测的1000个不同克隆中得到59个高活性启动子。以相应的转录调控序列控制肿瘤特异性启动子Hsp70cd,通过对几种不同肿瘤细胞株的瞬时转染实验筛选获得11个在肿瘤细胞中具有高活性的启动子。再以这些启动子调控腺病毒增殖必需基因E1A的表达,在细胞和荷瘤水平上验证这些启动子的肿瘤特异性和相应病毒的溶瘤效应。最终,我们获得了一个高肿瘤选择性溶瘤病毒,该病毒对肿瘤细胞的杀伤以及对肿瘤的抑制作用较之已用于临床治疗的美国ONYX药物公司研制的ONYX-015相比有上百倍的提高,具有很好的临床应用前景。