论文摘要
猪流行性腹泻（porcine epidemicdiarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的猪肠道传染病。该病1971年首次在英国被发现,随后,其它欧洲国家和部分亚洲国家相继报道了该病的发生与流行。以前,美国从未出现PEDV,但从2013年5月以来,美国多个州发生PEDV的流行,引起了美国乃至全球养猪业的高度重视。我国是上世纪80年代初首次发生PEDV。由于该病对新生仔猪的感染率和致死率均很高,给养猪业造成了巨大的经济损失。2010年冬季以来,流行性腹泻在我国10多个省市暴发并呈现新的流行特征：发病率和致死率高、流行广、损失大,而且以前接种过猪流行性腹泻疫苗的猪也未能幸免,提示该流行毒株毒力较强,而且可能与现有疫苗毒株存在较大的差异,导致现有疫苗难以提供免疫保护。有意义的是,美国2013年流行的PEDV在基因组水平上与我国流行的PEDV同源性高达99.5%,称为中国变异株。针对当前流行的猪流行性腹泻病毒,本研究开展了检测方法的建立、病毒的分离与鉴定,同时,对流行毒株的遗传进化特征进行了深入研究。主要研究内容如下：1. PEDV RT-PCR检测方法的建立及其流行病学调查针对PEDV高度保守的M基因设计了一对特异性引物,建立了PEDV的RT-PCR检测方法,该引物扩增片段大小为552bp。该方法特异性好、敏感性高,并且检测速度快,适于大样品的检测。利用建立的RT-PCR方法,对2010至2011年间从华中、华东、华南等地区9个省份采集的600多份临床样品进行检测,结果显示不同地区的临床样品其PEDV阳性率均超过50%,平均阳性率为58.32%,表明PEDV在我国流行十分广泛,感染率相当高。2. PEDV AJ1102株的分离、鉴定尽管PEDV的感染率很高,但国内外的研究表明,猪流行性腹泻病毒的分离相当困难、分离的成功率极低。将采自湖北省某猪场发病仔猪的临床样品接种Vero细胞,盲传3代后有一份临床样品接种的细胞可观察到明显的细胞病变,主要表现为细胞形成空泡的合胞体的病变,最后细胞发生裂解,PEDV特异性RT-PCR检测也证实为阳性；进一步采用间接免疫荧光实验证实病变的细胞能与PEDV特异性单克隆抗体发生反应,空斑实验测定该分离病毒滴度达106.0PFU/ml（F5代）。对分离的病毒通过梯度离心纯化并采用电子显微镜进行鉴定,能观察到直径大小约为100nm的病毒粒子以及明显的囊膜和纤突,具有典型的PEDV病毒粒子形态特征,证实所分离的病毒为PEDV,命名为PEDVAJ1102株。3. PEDV AJ1102株的全基因组序列测定与遗传进化分析参考以前所报道的PEDV全基因组序列,设计了16对引物,通过分段扩增的方法对PEDV AJ1102株进行了全基因组序列测定。结果表明：AJ1102株全基因组全长28044bp（GenBank accession number JX188454）,基因组排列与PEDV经典毒株CV777一样,排列顺序均为5’-ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N-3’.将AJ1102株以及目前国内外已测定全基因组序列的其它31株PEDV毒株进行比较,并利用MEGA4软件绘制系统发育树,发现32株PEDV可分为两个大群即Ⅰ群和Ⅱ群；其中Ⅰ群和Ⅱ群又被分为两个亚群即la、Ⅰb及Ha、Ⅱb。Ⅱ群主要由国内2010年以后报道的毒株以及2013年美国流行毒株组成。AJ1102株属于Ⅱa亚群,为新型的PEDV变异株,与处于Ⅰa亚群的经典毒株CV777遗传关系较远。4.PEDV AJ1102株主要基因的遗传进化分析本研究比较分析了AJ1102株5’UTR、3’UTR区域以及结构蛋白M、N、S、E和非结构蛋白ORF3的遗传进化特征。与经典毒株CV777相比,AJ1102株的5’UTR有5个碱基缺失、1个碱基插入和8个碱基突变；3’UTR无缺失或插入,但有10个碱基的突变；S基因的变异位点主要出现在S1区域（1-2217nt）,包括3个插入区域（168nt,176-186nt,431-433nt）和1个缺失区域（493-498nt）,而且AJ1102株S蛋白的核心抗原表位区（COE）有8个氨基酸突变,SS6（772LQDGQVKI779）抗原表位有1个氨基酸突变；M基因、N基因、ORF3和E基因均无插入或缺失,但存在一些碱基突变。对M、N、S、E、ORF3和E基因的进化分析显示,AJ1102株均与2010年以后分离的毒株处在同一分支,而与经典毒株CV777遗传关系较远,表明AJ1102株是当前的流行毒株,是研制针对当前PEDV流行毒株疫苗的候选毒株。5. PEDV流行毒株的遗传标志根据对全基因组以及主要结构蛋白的遗传进化分析,发现流行毒株S基因的S1区域具有较大的变异。为了探讨该区域是否具有目前我国PEDV流行毒株的特征性变异或遗传标记,针对S1区域的主要变异区设计了一对可扩增约450bp片段的特异性引物,对61份临床样品进行了RT-PCR扩增与序列分析,发现：目前在我国流行的PEDV毒株的S1基因具有特征性变异,提示这一特征性变异可以作为区分流行毒株和经典毒株的遗传标志,在实际操作中我们可以通过对该区域的检测,以确定特定猪场的PEDV是变异毒株还是经典毒株,为疫苗的选择提供理论依据。6.姜黄素对PEDV增殖的抑制作用研究中草药姜黄素不仅具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗诱变的作用,而且还具有抗病毒的作用,其对乙型肝炎病毒（HBV）,丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒等多种病毒均具有明显的抑制效果。然而姜黄素对PEDV是否具有抗病毒作用还未见报道。本研究利用10uM、20μM及30uM的姜黄素处理细胞后,再接种PEDVAJ1102毒株,并于感染后6h、12h和18h收集样品,通过空斑实验测定病毒滴度,发现姜黄素能够显著抑制PEDV的增殖,且呈时间和剂量依赖性。