棒曲霉毒素对HepG2细胞的遗传毒性及氧化应激机制的研究

论文摘要

目的:棒曲霉毒素（patulin,PAT）,是真菌的二级代谢产物。PAT存在于发霉的水果、蔬菜、谷物和动物饲料中,在烂苹果及苹果汁、苹果酒等苹果制品中含量较高。PAT主要的接触途径为消化道。世界卫生组织和世界上许多国家将苹果汁中PAT的最高允许浓度定为50μg/l。由于PAT对人类和动物致癌性的证据不足,国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer, IARC）将PAT对人类的致癌性列为第三类,即现有证据尚不能就其对人类致癌性进行分类。体外实验表明,PAT具有遗传毒性,但有关遗传毒性机制研究的报道不多。PAT可引起细胞内还原型谷光甘肽（GSH）含量的升高或降低,GSH是细胞内主要的抗氧化剂,因此,我们研究了PAT遗传毒性与细胞内GSH含量的关系,旨在探讨PAT遗传毒性的氧化应激机制。由于PAT经消化道途径进入体内,肝脏作为PAT代谢的最初部位,因此,本研究选用人肝癌细胞系（HepG2）作为试验系统。HepG2细胞保留了人类正常肝实质细胞的许多功能,还保留了生物转化I相酶和II相酶的活性,被认为是检测外来化合物遗传毒性的理想细胞系。本研究选用HepG2细胞,探讨PAT的遗传毒性及其可能机制,从而为评估PAT对人类健康的潜在危害提供实验室依据。方法:以HepG2细胞作为试验系统。分别用单细胞凝胶电泳（SCGE）试验和微核试验（MNT）检测细胞DNA损伤和染色体损伤。为探讨其可能的遗传毒性机制,采用DL—甲硫氨酸磺酰亚胺（BSO）和N—乙酰半胱氨酸（NAC）干预法测定细胞内GSH水平对PAT所致DNA及染色体损伤效应的影响,以2’,7’—二氢二氯荧光素（DCFH）法和苯二醛（OPT）分别测定细胞内活性氧（ROS）以及GSH水平,用硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定法检测细胞内脂质过氧化水平,以免疫组化方法检测细胞内8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达水平,以免疫印记法（western blot）检测细胞内p53蛋白的表达水平。实验结果用SPSS v 11.5统计软件包进行统计分析。结果:20μM—40μM的PAT作用于HepG2细胞1 h后,引起细胞DNA链断裂,形成彗星样脱尾,尾长、尾DNA含量及尾距增大,与未用PAT处理的细胞相比,其差异具有统计学意义（P<0.01）。0.38μM—0.75μM的PAT作用于HepG2细胞24 h可引起细胞微核率显著升高。采用150μM的BSO预处理HepG2细胞20 h来耗竭细胞内GSH,可明显增强PAT对HepG2细胞DNA及染色体的损伤,且呈剂量依赖关系;采用5 mM NAC提高细胞内GSH水平,可明显的降低PAT对HepG2细胞的染色体损伤效应。PAT作用于HepG2细胞1 h可引起细胞内ROS表达水平的显著增加及GSH的耗竭,其剂量分别为80μM和10μM—40μM。随着PAT染毒剂量的增加,细胞内8-OHdG表达水平增强,TBARS增多。0.75μM的PAT作用于HepG2细胞24 h后,细胞内p53蛋白表达增加,与对照组比较,其差异具有统计学意义。结论:PAT可引起HepG2细胞DNA损伤和染色体损伤,提示PAT具有遗传毒性。PAT引起细胞内ROS增高,GSH耗竭,并使细胞内8-OHdG的形成增强,表明PAT引起遗传毒性的机制可能与氧化性DNA损伤有关。此外,p53对防御PAT引起的HepG2细胞DNA损伤具有一定作用。

论文目录

• 一、摘要
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、正文
• （一） 前言
• （二） 材料和方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• （五） 结论
• （六） 参考文献
• 四、附录
• 五、致谢