论文摘要
端粒位于真核染色体末端，是稳定染色体末端的重要元件。端粒酶（TER）是一种特殊的细胞核糖核蛋白（RNP）反转录酶（RT），其核心酶包括蛋白亚基和RNA组件。在DNA复制过程中丢失的端粒可以被端粒酶修复。因此，端粒酶在维持细胞遗传结构完整性的过程中有重要作用，研究端粒酶在动物发生过程中的活性变化将有助于加深对动物胚胎发生机理的认识。为此，本研究对水牛卵母细胞、精子、颗粒细胞、成纤维细胞和各阶段早期胚胎的端粒酶活性进行了测定，以便深入了解水牛早期胚胎发生和体细胞克隆的机理。1．为建立一套适合水牛各细胞系和胚胎端粒酶活性检测及定量的方法，采用Telomerase TRAPeze Detection Kit结合银染方法对不同稀释浓度的293-细胞和不同水牛细胞（包括卵母细胞、精子、颗粒细胞、成纤维细胞及胚胎等）的端粒酶活性进行测定。结果发现，随着293-细胞抽提物的稀释所扩增的端粒重复片断信号逐渐减弱，经分析呈线性下降趋势，表明Telomerase TRAPeze Detection Kit可以用来检测细胞的微量端粒酶活性，通过计算相对端粒酶活性，水牛胚胎端粒酶活性水平相对高，精子和卵母细胞能够检测到端粒酶活性信号，颗粒细胞和成纤维细胞显著降低（P＜0.05）。2．为了解水牛卵母细胞和胚胎早期发育过程中端粒酶的活性变化，本研究使用试验一建立的TRAP-银染法水牛未成熟卵母细胞，成熟卵母细胞和2～4细胞，8～16细胞，桑椹胚以及囊胚各阶段的早期胚胎端粒酶活性进行了测定和定量分析。依据电泳条带在成像系统下的光密度值，计算端粒酶的相对活性（RTA）。结果发现，未成熟卵母细胞端粒酶活性比成熟卵母细胞高（P＜0.05），受精和孤雌激活后2～4细胞和8～16细胞胚胎端粒酶活性相对较低，桑椹胚端粒酶活性明显升高（P＜0.05），囊胚阶段达到最高水平。通过对水牛不同发育阶段胚胎细胞数计数及单细胞相对端粒酶活性的分析比较结果显示，卵母细胞的单细胞端粒酶活性最高，囊胚阶段的最低。单细胞端粒酶活性从未成熟卵母细胞到囊胚阶段呈逐渐降低的趋势。以上实验结果表明，TRAP-银染法检测灵敏度高、安全简便，适合水牛各细胞系的端粒酶活性检测。水牛卵母细胞及早期胚胎的端粒酶活性变化与其成熟、发育阻断及全能性的逐步降低有关。