烟夜蛾气味受体基因和精氨酸激酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

昆虫的嗅觉系统是一个高度专一和极其灵敏的化学检测器,可以识别环境中特异性的化学气味分子,并依此作为觅食、求偶、选择寄主及产卵场所和躲避天敌的信息,因此开展气味受体研究,对于探明昆虫识别气味分子机理有重要的意义;而在昆虫识别气味分子的过程中,气味受体引起的下游反应和气味结合蛋白对气味分子运输都需要能量的参与,而精氨酸激酶在能量代谢过程中起重要作用,对二者进行研究期望为昆虫识别气味分子过程的探明提供一些试验依据。本文主要研究内容包括:烟夜蛾气味受体基因的克隆和组织表达;精氨酸激酶基因的克隆、在烟夜蛾不同组织、发育期的表达以及高低温的诱导表达。主要研究结果如下:（1）利用RT-PCR方法,获得了烟夜蛾气味受体基因长度为1197bp的cDNA阅读框架（ORF）;该基因推导表达399个氨基酸残基,推测编码蛋白质的分子量46.6KD,等电点为5.82。利用生物信息学在线工具SOSUI对HassOR18受体的氨基酸序列的跨膜结构进行预测,结果表明,序列中含有7个跨膜区,具有昆虫气味受体典型的结构特征。氨基酸序列比对表明,获得cDNA所编码的氨基酸与其他夜蛾科昆虫HassOR18气味受体的氨基酸序列的一致性均达80%以上,因此,将此基因暂命名为HassOR18,该基因已在GenBank中登录,登录号为HM750915。（2）利用荧光定量PCR方法,研究了HassOR18基因在烟夜蛾不同组织中的转录水平,结果表明,HassOR18基因在雌雄虫触角中和雌虫喙内表达,而且雄虫触角远高于雌虫触角和雌虫喙内的表达量。（3）利用RT-PCR和3’RACE-PCR方法扩增获得了烟夜蛾精氨酸激酶基因的cDNA序列,序列分析结果表明,该基因片段编码区长为1068 bp,3’端非编码区长为238 bp,编码区推导表达356个氨基酸残基,预测所编码的蛋白质分子量为40.0 KD,等电点为5.76。Prosite功能序列分析结果表明,该AK氨基酸序列中的氨基酸CPTNLGT（270-276）、第61位天冬氨酸（Asp）和第192位的精氨酸（Arg）高度保守,而且CPTNLGT是AK的活性中心部位序列,其中第270位的半胱氨酸（C）是AK所必需的酶活性位点,第61位的天冬氨酸与第192位的精氨酸可以形成离子偶结构。烟夜蛾与其他昆虫的AK基因的氨基酸序列一致性都在70%以上,该基因暂命名为HassAK,已在Genbank上登录,登录号为HQ336337。（4）利用荧光定量PCR方法,研究了HassAK基因在烟夜蛾不同发育期和组织中的转录水平。结果表明,HassAK基因在4龄幼虫期和预蛹期转录水平相对较高;在4龄后转录水平逐渐降低,到5龄第2天达到最低,之后逐渐上升并在预蛹期达到最大转录水平,之后逐渐降低。推测该基因可能受蜕皮激素调控。在不同组织中,HassAK基因在腹足、中肠中的转录水平较高,在头部、脂肪体和表皮中的转录水平相对较低。（5）利用逆境条件刺激和荧光定量PCR方法,研究了高温、低温条件处理后,HassAK基因在5龄烟夜蛾幼虫脂肪体中的转录情况。结果表明,不同逆境条件刺激对HassAK基因的转录都有很强的促进作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 昆虫嗅觉相关蛋白及其功能
• 1.2 昆虫气味受体的研究进展
• 1.2.1 传统气味受体及其功能
• 1.2.2 Or83b 家族受体及其功能
• 1.2.3 昆虫气味受体的结构及其传导机制
• 1.3 精氨酸激酶的研究进展
• 1.3.1 精氨酸激酶的组织化学研究
• 1.3.2 精氨酸激酶的分子研究进展
• 1.3.3 精氨酸激酶基因在昆虫体内的表达
• 1.3.4 精氨酸激酶的结构特征及其cDNA 的序列特征
• 1.3.5 精氨酸激酶与蜕皮激素的关系
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 供试材料
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 菌种
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 仪器设备
• 3.1.6 实验中所用的主要溶液
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 不同组织和不同龄期总RNA 提取步骤
• 3.2.2 反转录
• 3.2.3 引物的设计和合成
• 3.2.4 PCR 扩增
• 3.2.4.1 烟夜蛾HassOR18 基因片段的扩增
• 3.2.4.2 烟夜蛾HassOR18 基因在不同组织中的表达
• 3.2.4.3 烟夜蛾HassAK 基因cDNA 片段的扩增（内部扩增）
• 3.2.4.4 烟夜蛾HassAK 基因cDNA 3’末端的扩增（3’RACE）
• 3.2.4.5 烟夜蛾HassAK 基因在不同组织和发育期的表达
• 3.2.4.6 温度对精氨酸激酶基因转录水平的影响
• 3.2.5 PCR 产物的琼脂糖电泳检测
• 3.2.6 PCR 产物的纯化
• 3.2.7 克隆载体与PCR 纯化产物的连接
• 3.2.8 感受态细胞的制备和质粒的转化
• 3.2.8.1 感受态细胞的制备
• 3.2.8.2 质粒向克隆菌株的转化
• 3.2.9 质粒DNA 提取
• 3.2.10 阳性克隆的筛选
• 3.2.11 核苷酸序列测定
• 4 结果与分析
• 4.1 烟夜蛾HassOR18 基因的cDNA ORF 阅读框架的扩增、克隆和序列测定
• 4.2 烟夜蛾HassOR18 基因cDNA 的序列分析
• 4.3 烟夜蛾HassOR18 基因在不同组织的定量分析表达
• 4.4 烟夜蛾HassAK 基因cDNA 的扩增、克隆和序列测定
• 4.5 烟夜蛾HassAK 基因cDNA 序列分析
• 4.6 烟夜蛾HassAK 基因在幼虫不同组织内的表达
• 4.7 烟夜蛾HassAK 基因在不同发育时期的表达
• 4.8 温度对烟夜蛾HassAK 基因表达水平的影响
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 参考文献
• Abstract