论文摘要
MicroRNA-182与淋巴细胞肿瘤糖皮质激素耐药的相关性研究目的糖皮质激素（GCs）是血液肿瘤化疗方案中的一线用药,而糖皮质激素耐药则是化疗失败的主要原因,导致疾病的难治和复发。目前关于糖皮质激素耐药机制的研究则是临床解决攻破的难题之一。FoxO3a是FOXO家族的关键成员之一,介导着细胞转导途径特别在调控细胞凋亡上,有着特殊的角色作用,且在GCs行使作用中,是不可或缺的参与者。但是FoxO3a的调控机制非常复杂,很多机制尚不清楚。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性表达的小分子非编码RNA,能够在转录后水平调控基因的表达,已成为当前研究的热点。本项研究,我们拟探讨在淋巴细胞肿瘤中（?）miRNA-182对FoxO3a的调控以及它们与淋巴细胞肿瘤糖皮质激素耐药的相关性。方法a)用qRT-PCR检测不同糖皮质激素敏感性的淋巴细胞肿瘤细胞株的miRNA-182的表达水平。b)用流式细胞术（FCM）行凋亡检测,筛选和鉴定糖皮质激素敏感淋巴细胞肿瘤细胞株和糖皮质激素耐药的淋巴细胞肿瘤细胞株,以及用CCK-8法进行不同淋巴细胞肿瘤细胞株的糖皮质激素耐药程度比较。c)用Western blot的方法分别检测糖皮质激素敏感淋巴细胞肿瘤细胞株以及糖皮质激素耐药淋巴细胞肿瘤细胞株在接受糖皮质激素预孵育前后总FoxO3a和磷酸化FoxO3a的变化。d)通过流式细胞仪检测表达绿色荧光素的淋巴细胞肿瘤细胞评估miRNA的转染效率。选择较高转染效率的细胞株,行（?）niRNA-182过表达,并用RT-PCR检测过表达miRNA-182后,细胞株miRNA-182的表达量的变化,并用Western blot的方法检测转染后,糖皮质激素预孵育淋巴细胞肿瘤细胞株前后总FoxO3a和磷酸化FoxO3a的变化。e)在糖皮质激素敏感细胞株CCRF-CEM中,过表达miRNA-182 24h后,加入等量糖皮质激素孵育48h后收集细胞,用流式细胞术（FCM）行凋亡检测；同时Western blot检测Bim蛋白水平。f)在糖皮质激素耐药细胞株HUT-78中,沉默miRNA-182 24h后,加入等量糖皮质激素孵育48h后收集细胞,用流式细胞术（FCM）行凋亡检测；同时Western blot检测Bim蛋白水平。结果1. miRNA-182在不同淋巴细胞肿瘤细胞株内表达各异,耐药细胞株Jurkat相对表达量最高,Molt-4表达量仅次之,而敏感细胞株SUP-B15以及野生型脾细胞表达量相对极低。2.淋巴细胞肿瘤细胞株中,糖皮质激素耐药细胞株Jurkat和Molt-4,二者在浓度高达10μM的地塞米松的孵育48h后,凋亡率少于5%；在糖皮质激素敏感的脾细胞及SUP-B15细胞株中,分别用100nM地塞米松孵育8h和36h,凋亡容易发生,凋亡率可达50%以上；另外,不同地塞米松浓度下行凋亡率比较,Jurkat明显比Molt-4耐药；而且比较不同地塞米松浓度处理下CCRF-CEM与HUT-78的细胞存活率,CCRF-CEM明显比HUT-78敏感,耐药程度明显低于HUT-78。3.选择用转染效率较高的淋巴细胞肿瘤细胞株CCRF-CEM,过表达miRNA-182,总FoxO3a随着miRNA-182转染量的增加而抑制越明显,50nM抑制效果最佳,而磷酸化FoxO3a表达水平不受影响。4.对地塞米松敏感的淋巴细胞肿瘤细胞株受到地塞米松作用后,总FoxO3a升高,磷酸化FoxO3a减少,而对地塞米松耐药的血液肿瘤细胞株在接受地塞米松处理前后变化不大。5.过表达miRNA-182,可增强淋巴细胞肿瘤细胞株抵抗糖皮质激素诱导的凋亡；在CCRF-CEM细胞株中,过表达miRNA-182, 1μM浓度地塞米松作用下,与空白对照相比,凋亡率被下调,Bim表达量较低。6.沉默miRNA-182,可增加淋巴细胞肿瘤细胞株对糖皮质激素诱导的凋亡；在HUT-78细胞株中,沉默miRNA-182, 10μM浓度地塞米松作用下,凋亡率较空白对照上调,Bim表达量较高。结论1.在糖皮质激素敏感的淋巴细胞肿瘤细胞株中,其磷酸化FoxO3a水平显著降低,而总FoxO3a水平升高,但对于糖皮质激素耐药的淋巴细胞肿瘤细胞株,总FoxO3a和磷酸化FoxO3a的水平变化均不大,推断改变FoxO3a的基因表达水平或者磷酸化状态的改变,可能一定程度上影响并反映淋巴细胞肿瘤对糖皮质激素的敏感程度。2. miRNA-182能够有效下调淋巴细胞肿瘤的FoxO3a的蛋白表达水平,并呈浓度依赖关系,而非改变磷酸化FoxO3a的蛋白表达水平。3.外源性干预miRNA-182表达水平,影响着淋巴细胞肿瘤对糖皮质激素的敏感性。4.比较多种淋巴细胞肿瘤细胞株中（?）niRNA-182表达丰度,糖皮质激素敏感细胞株表达量相对较低,糖皮质激素耐药细胞株表达量相对较高,推断淋巴细胞肿瘤糖皮质激素耐药的发生,可能与细胞内异常表达的miRNA-182相关。
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